配位自组装的高效电化学界面对色氨酸的手性识别

雷 鹏， 周 影， 洪沙沙， 杨亚娟， 双少敏

(山西大学化学化工学院，山西太原 030006)

手性是大多数生物分子固有的特性之一，而氨基酸作为组成生命物质的基本单元，不同构型的氨基酸在生物体内发挥着不同作用[1]。例如，人体所需的蛋白质主要是由L-氨基酸参与合成，而D -氨基酸非但不参与人体内蛋白质合成，并可能引起严重的副作用[2]。L-色氨酸(L-Trp)是褪黑素和5-羟色胺的蛋白质和前体的必需成分，可改善睡眠、情绪和精神健康[3]，当人体内的L-Trp含量失调，还会引起多种慢性疾病。目前，L-Trp已经被用于安神药物、食品以及饲料添加剂，而D -Trp属于非蛋白光学活性的氨基酸，是抗癌和免疫药物的重要前驱物质。因此，在生命科学和其他相关领域中，构建一种用于识别手性Trp对映异构体的检测方法至关重要。目前，检测Trp对映异构体的技术主要包括化学发光法[4]、高效液相色谱法[5]、荧光微量法[6]和电化学方法[7]等。与其他方法相比，电化学方法因具有操作简单，制备方便，灵敏度高等优点被广泛应用于氨基酸对映异构体的测定[8 - 9]。

为了提高灵敏度，在传感器中引进高性能纳米材料已经成为研究的热点，如碳纳米管(CNTs)[10]、石墨烯[11]和导电聚合物[12 - 13]。多壁碳纳米管(MWCNTs)因其高比表面积，高化学稳定性，优异的导电性而被广泛地用于电化学研究。此外，MWCNTs和聚合物形成的复合材料不仅对一些生物分子具有优异的电催化能力，而且可以表现出协同作用[14]。

超分子化学的发展为手性化合物的鉴别提供了新的途径。环糊精是由七个葡萄糖分子组成的环状多糖，可作为形成超分子结构的理想宿主[15 - 16]，且已广泛用于从生物环境中选择性提取手性化合物。由于其亲水外表面和疏水内腔，它能够与尺寸合适的分子形成包合物，因此常被用作识别氨基酸对映异构体。Ou等[17]以石墨烯量子点-β-环糊精(GQD/β-CD)复合材料修饰电极， 利用GQD放大电化学信号及提高识别效率和β-CD的手性微环境，成功识别了Trp对映体。Zaidi[18]将β-CD/还原氧化石墨烯(RGO)复合材料滴凃于电极表面，成功手性识别了苯丙氨酸对映异构体。本文将Cu2+配位在β-CD的宽口处，以Cu2+充当顶盖，并且迫使Trp异构体通过β-CD的较窄开口进入形成氢键，从而达到识别效果。通过循环伏安法将L-精氨酸聚合到MWCNTs表面，进一步将修饰电极浸泡在Cu2+修饰的β-CD中,使其自组装在电极表面，从而得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs复合膜，并将其修饰在玻碳电极(GCE)表面，以MWCNTs膜作为基底，PLA、Cu-β-CD作为识别元件，构建手性电化学传感器，从而对Trp对映异构进行手性识别和检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；UV-2450分光光度计(日本，岛津公司)；TensorⅡ红外光谱仪(德国，Bruker optics公司)。

L-色氨酸(L-Trp，99%)，D -色氨酸(D -Trp，98%)，L-精氨酸(L-Arg，99%),β-环糊精(β-CD)，多壁碳纳米管(MWCNTs)和CuSO4·5H2O，均购于阿拉丁试剂公司(中国上海)，其他所用试剂均为分析纯。所有溶液都用超纯水(18.2 MΩ·cm)制备。

1.2 Cu-β -CD的制备

将15 mL 0.04 mol·L-1的CuSO4溶液加至含0.02 mol·L-1β-CD的10 mL NaOH溶液(0.5 mol·L-1)中，有蓝色沉淀Cu(OH)2生成，室温下持续搅拌12 h，过滤除去沉淀，在滤液中加入200 mL乙醇，形成蓝色絮状物。静止12 h后将其过滤，用乙醇充分洗涤，在真空干燥箱中于25 ℃下干燥后，备用。

1.3 PLA/MWCNTs/GCE的制备

首先对裸玻碳电极(GCE)用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3依次进行打磨，进一步在无水乙醇和超纯水中超声处理1 min，自然晾干后，取6 μL的MWCNTs(0.6 mg·mL-1)滴涂在GCE表面，红外灯下烘干，最后用超纯水冲洗除去松散吸附的MWCNTs。将MWCNTs/GCE浸泡在含有2.5×10-3mol·L-1L-Arg 的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=6.0)中，采用循环伏安法在-1.6～1.8 V电位范围以100 mV·s-1扫描10圈，取出用超纯水淋洗，室温晾干得到PLA/MWCNTs/GCE。

1.4 Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE的制备

将PLA/MWCNTs/GCE浸泡在含有5.0×10-3mol·L-1Cu-β-CD的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)中20 h，得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE。

2 结果与讨论

2.1 不同电极修饰材料的扫描电镜(SEM)表征

图1A、1B和1C分别是MWCNTs、PLA/MWCNTs和Cu-β-CD/PLA/MWCNTs的SEM图。MWCNTs呈现网状结构没有聚集，这种结构可以有效地提高比表面体积并促进电子转移。L-Arg在MWCNTs表面电聚合后，MWCNTs被包埋在LPA基质中并观察到多孔簇状纳米复合膜，多孔簇状结构可能会扩大修饰电极的界面并提供更多的识别位点以扩大识别差异。Cu-β-CD自组装后形成光滑的褶皱膜结构，同时也表明Cu-β-CD已成功组装到PLA/MWCNTs表面。

图1 MWCNTs(A)、PLA/MWCNTs(B)和Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of MWCNTs(A),PLA/MWCNTs(B) and Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)

2.2 不同修饰电极的电化学表征

采用循环伏安法(CV)研究了在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1 mol·L-1KCl)中不同电极界面的电化学行为(扫描速率为100 mV·s-1)。如图2A所示，在裸GCE上观察到一对对称氧化还原峰，用MWCNTs修饰电极后，电流信号明显增强，证明MWCNTs可以促进电子转移效率。当L-Arg 引入MWCNTs/GCE表面时，其电流信号略有提高。Cu-β-CD在PLA表面自组装后，由于Cu-β-CD导电能力弱，使得峰电流减小。

进一步通过电化学交流阻抗谱(EIS)对不同电极界面进行研究。如图2B所示，与裸GCE相比，MWCNTs/GCE的阻抗显著降低，表明MWCNTs有良好的导电性并且能促进电子转移。L-Arg聚合到表面后，半圆几乎消失，然而Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE显示出最大的阻抗(800 Ω)，这与CV法的结果一致。

图2 不同电极在含0.1 mol·L-1 KCl的5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循环伏安图(CVs)(A)和交流阻抗图(EIS)(B)Fig.2 CVs(A) and EIS(B) of different electrodes in 5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4- solution containing 0.1 mol·L-1 KCl

2.3 修饰电极对色氨酸异构体的识别

在0.1 mol·L-1PBS(pH = 8.0)中，通过示差脉冲伏安法(DPV)研究1.0×10-3mol·L-1L-Trp和D -Trp 在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的电化学行为(图3)。在裸GCE上，Trp异构体之间几乎没有峰值差异。当引入MWCNTs时，Trp异构体的峰电流明显增强，然而电位差仍然很小，表明MWCNTs对Trp的氧化具有电催化作用。而PLA/MWCNTs/GCE对Trp的对映选择性明显提高，其峰电流比(IL/ID)为2.90，这可能归因于L-Arg和Trp对映体之间的相互作用。当Cu-β-CD引入时，识别效果进一步提高，峰电流比为3.37，电位差为68 mV。通过Trp在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的识别效果，可知识别能力是P-L-Arg和Cu-β-CD的协同作用，增加了手性识别的差异，从而提高了识别效率。

图3 1.0×10-3 mol·L-1的L-Trp(a)和D -Trp(b)的在不同电极上的示差脉冲伏安(DPV)响应Fig.3 DPV responses of 1.0×10-3 mol·L-1 L-Trp(a) and D -Trp(b) at different electrodes(A) bare GCE;(B) MWCNTs/GCE;(C) PLA/MWCNTs/GCE;(D) Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE.

2.4 Trp对映异构体的电化学检测

为了进一步研究不同浓度Trp对映异构体在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的电流响应，采用DPV法对一系列浓度的Trp对映异构体进行检测，结果见图4。结果表明随着Trp浓度增大，电流响应信号也随之增大，并且与Trp浓度呈线性关系。在1.0×10-6～5.5×10-5mol·L-1范围内呈现良好的线性相关，检出限(S/N=3)可达3.3×10-7mol·L-1。二者的线性方程分别为：Ip(μA)=2.079+0.293cL-Trp(R2=0.9945)；Ip(μA)=2.143+0.104cD -Trp(R2=0.9932)。

图4 不同浓度L-Trp(A)和D -Trp(B)对映异构体在Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE上的DPV响应(内插图为相应校正曲线)Fig.4 DPV responses of different concentrations for L-trp(A) and D -Trp(B) at Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE(Inset shows the corresponding calibration plots)

2.5 Trp对映异构体检测比较

目前，采用电化学方法对Trp对映异构体识别和检测已取得了很大的进展。在表1中，将本方法与现有的研究成果进行比较，结果证明Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE对Trp对映异构体展现出较高的手性识别、较低的检测限和较宽的线性范围。

表1 色氨酸对映异构体识别方法对比

3 结论

本文将Cu-β-CD自组装在PLA/MWCNTs纳米复合膜上，然后修饰在玻碳电极表面，构建了一个电化学手性传感器Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE，并将其用于L-Trp和D -Trp的手性识别研究。由于L-Trp 和D -Trp的空间构型的差异，导致异构体与Cu-β-CD产生不同程度的包合作用，从而达到手性识别效果。实验结果表明，该传感器可以对Trp手性异构体进行有效地识别检测，有望应用于实际检测中。