“关-开”型碳量子点荧光探针测定左旋多巴的研究

马红燕， 武文波， 张越诚， 田 锐， 张会芳

(延安大学化学与化工学院，延安市分析技术与检测重点实验室，陕西延安 716000)

碳量子点(CQDs)是一种新型的碳纳米功能材料，尺寸一般为1～10 nm，其具有生物毒性低、荧光稳定、水溶性好、容易制备和生物相容性好等优点[1]。目前CQDs的制备主要以人工制备的含碳化合物为原料，其制备过程繁琐，反应条件苛刻[2]。近年来，一些利用天然生物物质，如枫树叶[3]、枸杞[4]为原料制备CQDs的方法被相继报道。

左旋多巴(Levodopa，LDOPA)是一种抗震颤麻痹类物质，其经过血脑屏障进入中枢，经多脱羧酶变成多巴胺后产生作用，可用于治疗帕金森综合症[5]。现已报道测定LDOPA的方法，主要有薄层色谱法[6]、毛细管电泳法[7]、高效液相色谱法[8]、电化学发光法[9]和分光光度法[10 - 11]等。这些方法有的仪器设备昂贵，有的操作过程繁琐，有的线性范围窄、检出限高。因此，进行LDOPA灵敏、准确、快速测定新方法的研究显得尤为必要。

实验发现，选用淀粉为碳源，通过一步水热法可合成强荧光的CQDs。在研究淀粉CQDs发光性能的过程中，发现KMnO4的加入可使CQDs的荧光猝灭，荧光信号“关闭”；当继续加入LDOPA后，CQDs的荧光恢复为“打开”状态，可构建“关-开”型荧光探针，据此提出了基于CQDs荧光探针测定LDOPA的新方法。该方法成本低廉、灵敏度高、检出限低。该研究为LDOPA的检测提供了新方法，同时也拓展了CQDs的应用范围。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FLSP920型瞬态稳态荧光光谱仪(英国，爱丁堡)；F-4500型荧光分光光度计(日本，日立)；IR Prestige-21型傅里叶变换红外光谱仪(日本，岛津)；8453型紫外-可见分光光度计(美国，安捷伦)。

LDOPA溶液：准确称取0.0237 g LDOPA对照品(中国药品生物制品检定所)，用10.0 mL 1.0 mol/L的HCl溶解后，以水定容到100 mL，浓度1.0×10-3mol/L，使用时逐级稀释。KMnO4溶液：1.0×10-3mol/L。所用其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 CQDs的合成称取8.00 g淀粉于25 mL聚四氟乙烯反应釜中，再加3.0 mL乙二胺、10.0 mL超纯水后，于180 ℃恒温加热18 h，将反应釜自然冷却至室温，得深棕色溶液，经滤纸粗过滤后，再用孔径为0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液定容至100 mL容量瓶中，稀释100倍后使用。

1.2.2 LDOPA的测定依次移取1.0 mL CQDs溶液，2.0 mL KMnO4溶液，2.0 mL 1.0 mol/L HCl，适量LDOPA 溶液于10 mL比色管中，用水稀释至刻度，摇匀。60 ℃恒温水浴加热30 min，流水冷却5 min，于荧光分光光度计上，在λex/λem=397/452 nm处测定体系的荧光强度F和试剂空白的荧光强度F0，其中光谱狭缝均为5.0 nm，并计算体系荧光强度变化ΔF(ΔF=F-F0)。

2 结果与讨论

2.1 CQDs光学性质分析

2.1.1 CQDs的荧光光谱图1为不同激发波长下CQDs的荧光光谱，由图可知该CQDs的发射峰强度和位置具有激发波长依赖性。当激发波长由380 nm增加到420 nm，发射波长由442 nm红移至483 nm，荧光强度先增大后减小，当激发波长为397 nm时，发射波长为452 nm，荧光强度达到最大。

2.1.2 CQDs的红外光谱CQDs的红外光谱图如图2所示，2 930 cm-1处可能是-CH2的特征吸收峰，2 360 cm-1处的吸收亦或是-C≡C、-CN等的伸缩振动，2 000 cm-1为R′-C≡C-R的吸收峰。1 648 cm-1可能为-C=O的特征吸收峰，1 558 cm-1处的吸收峰可能为-C=C-的伸缩振动。1 210 cm-1可能是C-OH的吸收峰也可能是酚的吸收峰。1 080 cm-1为C-N的伸缩振动吸收，而876 cm-1附近也有吸收峰，可能为C-C键骨架振动。由此分析得，该CQDs表面含有-OH、-C=O、-COOH等亲水性基团，因此，CQDs具有良好的水溶性。

图1 不同激发波长下CQDs的荧光光谱图Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs with different excitation wavelengths

图2 CQDs的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱图Fig.2 The FT-IR spectrum of CQDs

图3 CQDs的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectrum of CQDs

2.1.3 CQDs的紫外-可见吸收光谱图3为CQDs的紫外-可见吸收光谱图，CQDs在282 nm波长处有一中等强度的吸收峰，在353 nm处有一较强的吸收峰，此为CQDs典型的紫外-可见吸收峰，其归因于共轭碳碳双键的π-π*跃迁所形成[12]。

2.1.4 CQDs的荧光寿命和量子产率通过瞬态稳态荧光光谱仪对CQDs的荧光寿命进行测定，其加权平均荧光寿命[13]为7.26 ns。采用参比法，以硫酸奎宁为标准物质[14]，测得CQDs的荧光量子产率为10%。

2.1.5 CQDs“关-开”型荧光探针的构建室温下，扫描体系在激发波长λex=397 nm下的荧光光谱，如图4(A)所示。KMnO4的加入对CQDs的荧光有明显的猝灭作用，使其荧光信号“关闭”；LDOPA加入后，CQDs荧光恢复，荧光信号“打开”。在该激发波长下，LDOPA无明显荧光，LDOPA与KMnO4的产物也无明显荧光，LDOPA对CQDs的荧光也没有直接的猝灭作用，故对实验结果不会造成影响。由图4(B)可知，CQDs的荧光信号恢复值随着LDOPA浓度的增加有规律的增加，据此可用于LDOPA的测定。

图4 (A)可行性实验；(B)随左旋多巴浓度增加荧光信号恢复图Fig.4 (A) Feasibility of experiment;(B) Fluorescent signal recovery with increasing levodopa concentration

2.2 实验条件优化

2.2.1 酸度的影响研究了酸度对体系ΔF的影响，结果表明在2.0 mL 1.0 mol/L HCl中，体系荧光恢复值ΔF最大且稳定。

2.2.2 CQDs用量的选择试验了0.5～5.0 mL CQDs溶液对ΔF的影响，结果表明CQDs溶液的用量为1.0 mL时，体系的ΔF达到最大值。

2.2.3 KMnO4用量的选择KMnO4的浓度会直接影响检测LDOPA的背景值和线性范围。实验研究发现，KMnO4的用量少，CQDs猝灭效率低，荧光背景高，LDOPA检测的线性范围窄。而随着KMnO4浓度的增加，CQDs的猝灭作用加强。但是KMnO4浓度不能过大，若KMnO4浓度过大，加入的LDOPA会首先与游离的KMnO4反应，会降低LDOPA的有效浓度，影响荧光恢复效率。综合考虑，实验选择加入2.0 mL 1.0×10-3mol/L KMnO4溶液。

2.2.4 温度、加热时间和稳定性实验CQDs与KMnO4混合后，CQDs荧光猝灭信号至少在12 h内保持稳定。相比于CQDs-KMnO4体系的稳定性，LDOPA加入后，CQDs-KMnO4-LDOPA体系信号的“打开”在常温下进行的比较缓慢，故采用加热来加快反应速率。分别研究了不同加热时间、不同温度对ΔF的影响，结果表明在60 ℃恒温水浴中加热30 min后，荧光恢复程度达到最大。

2.3 共存物质的影响

在选定的实验条件下，研究了常见共存物对1.5×10-5mol/L LDOPA溶液测定结果的影响。相对误差控制在±5%范围内，1 000倍的Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Ba2+、Zn2+、D -果糖、蔗糖、糊精、淀粉，500倍的葡萄糖、Ag+，50倍的Cu2+不干扰测定。可见该方法具有较好的选择性。

2.4 线性范围、检出限和精密度

在优化的条件下，测定LDOPA浓度与ΔF之间的关系。结果表明，当LDOPA浓度在1.0×10-7～1.5×10-5mol/L范围内时，荧光强度恢复值与其浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为：ΔF=2.2×107c+29.30，相关系数r为0.9980，该方法的检出限(3σ/k)为4.5×10-8mol/L。对浓度为1.5×10-5mol/L的LDOPA标准溶液平行测定5次，其相对标准偏差为1.3%。

2.5 样品测定

随机抽取同一批号的LDOPA药片10片，准确称取适量研磨后的粉末(相当于0.0237 g LDOPA)用10.0 mL 1.0 mol/L HCl溶解，超声10 min后移至100 mL的容量瓶中，以水定容，摇匀后静置10 min，将其过滤，弃去初滤液，移取一定量续滤液，按照实验方法测定，同时进行加标回收实验，结果见表1。其中样品1购于北京曙光药业有限责任公司，产品批号：161201，规格：250 mg；样品2购自湖南恒伟药业股份有限公司，产品批号：湘01070005，规格：250 mg。

表1 样品测定结果及回收率实验(n=5)

2.6 反应机理初探

将KMnO4溶液加入到CQDs后，CQDs的荧光发生强烈猝灭，体系荧光信号“关闭”；再将LDOPA加入上述CQDs-KMnO4体系中后，CQDs荧光得到恢复，体系的荧光信号呈“打开”状态。推测其机理如下：KMnO4具有强的氧化性，当KMnO4加到CQDs溶液中后，KMnO4通过与CQDs表面基团的作用而结合于CQDs表面，即KMnO4通过电子转移的方式占据CQDs表面，使CQDs的表面激发态以一种非辐射电子转移方式释放其能量，CQDs的荧光猝灭，使得荧光信号“关”。当LDOPA加入到CQDs-KMnO4体系中后，由于LDOPA强的还原性，更易于与KMnO4作用，把KMnO4从CQDs表面移除下来，荧光信号“开”，使CQDs的荧光得到恢复，其可能机理如图5所示。

图5 CQDs的荧光“关-开”机理图Fig.5 The mechanism of CQDs quenching and fluorescence recover

3 结论

通过一步水热法合成了CQDs并对其发光性能进行了研究。在HCl介质中，基于LDOPA对被KMnO4已猝灭的CQDs的荧光有恢复作用，建立了高灵敏度“关-开”型荧光探针对LDOPA定量检测的荧光分析新方法。该研究拓展了CQDs在药物荧光分析中的应用范围，为临床测定LDOPA提供了新方法。