有氧运动和谷氨酰胺对二型糖尿病大鼠氧化应激及相关因子表达的影响*

王小梅，景会锋

(延安大学体育学院，陕西 延安 716000)

众多研究表明，糖脂代谢紊乱、氧化应激损伤和炎性因子应答能力下降与糖尿病的发生、发展有着密切的关联[1-2]。在二型糖尿病(type 2 diabetes,T2MD)患者中大约有50% 合并血脂异常，导致心血管等出现慢性炎症反应[3]；氧化应激损伤也占有重要作用，活性氧不但造成胰岛β 细胞的损伤，还能激活某些应激敏感通路，通过对相关因子表达的调节，诱发胰岛素抵抗，导致或加重糖尿病[4]。目前的研究也表明，在人类和啮齿动物中，慢性炎性已经成为胰岛素抵抗、T2MD和心血管疾病的治疗靶标[5]。糖尿病固有的免疫炎症反应会引起机体多系统的功能障碍，炎性反应失调引起胰岛素的抵抗等各种并发症，进而加重病情。谷氨酰胺(glutamine,Gln)具有多种免疫调节功能、参与糖代谢的调节、同时也是合成体内还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)的重要前提物质，谷胱甘肽在机体主要是参与细胞保护作用，能够增加机体抗氧化能力，降低活性氧的产生，降低中性粒细胞对组织的浸润[6]。研究表明肥胖及T2MD患者体内Gln减少[7]。而运动对于防治糖尿病有积极作用[8]。运动在降低体脂的同时可改善骨骼肌质量，调节糖脂的代谢；增强机体的抗氧化能力；促进抗炎因子白介素6等的表达进而强烈抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达，减轻炎症反应程度；改善胰岛素的抵抗，且不同运动方式影响不同[9]。因此，本研究观察有氧运动和外源性补充Gln联合干预对T2MD糖脂代谢紊乱、氧化应激损伤和炎性因子应答能力的影响，旨在为制定改善糖尿病患者的症状和预防并发症发生的措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

链脲佐菌素(STZ)购买于Sigma公司，溶于 0.1 mmol/L枸椽酸缓冲液内，pH=4.2，现配现用；血糖和血脂测定应用东芝全自动生化分析仪；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的测试严格按照试剂盒说明，试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；血清脂联素、瘦素和TNF-α检测用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 动物

雄性SD大鼠50只(购于西安交通大学实验动物管理中心)，6周，体重220～270 g，动物室内温度(22±2)℃，相对湿度45%～55%，自然昼夜照明，分笼饲养，自由饮水，普通饲料为标准啮齿类饲料，高脂饲料为含胆固醇2%，猪油10%，胆酸钠0.5%。

1.3 大鼠分组及DOP模型的建立

适应性喂养1周后，随机分为5组：安静对照组(N)、糖尿病对照组(D)、糖尿病施加有氧运动组(DE)、糖尿病施加谷氨酰胺组(DG)、糖尿病施加有氧运动+谷氨酰胺组(DEG)，每组各10只。N组大鼠正常饲料喂养，不加任何干预，D、DE、DG和DEG组大鼠造模组高脂饲料喂养2个月，在禁食16 h后一次性腹腔注射35 mg/kg STZ[10]，注射7 d后尾静脉采血测试血糖浓度，血糖浓度大于16.7 mmol/L，且持续三周，为成模大鼠。

1.4 Gln干预

Gln购自 Sigma公司，DG组和DEG组大鼠第一周预适应训练期间不补充Gln，正式训练期间于每次训练前1 h用灌胃针灌胃Gln混悬液2 ml(0.8 g/(kg·d))[11]，N组、D 组和DE组每天灌胃等体积的蒸馏水。

1.5 运动训练方案

EG、DE和DEG组大鼠采用递增负荷的方式进行跑台有氧运动，起始速度为10 m/min，时间为20 min，适应性训练1周后开始正式训练。运动负荷参考Bedford的研究加以调整[12]，每周训练5 d，速度逐渐递增由10 m/min增至24 m/min，训练时间递增值为5 min/d，整个训练过程共持续8周。

1.6 仪器设备与观察指标的测定

于末次训练结束后，按50 mg/kg的剂量腹腔注射2%的戊巴比妥钠溶液麻醉后，迅速分离颈总动脉，采血4 ml，注入含乙二胺四乙酸钠30 μl和10%抑肽酶40 μl的试管中，混匀，离心半径12 cm，离心(3 000 r/min，10 min，4℃)，分离血浆，-20℃保存，备用待测血糖、SOD、GSH-Px、MDA、胰岛素和血脂。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清中的SOD活性和MDA含量变化的比较

由表1可知，与N组相比，D组大鼠血清中SOD和GSH-Px活性明显下降(P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)；与D组相比，DE、DG和DEG组大鼠血清中SOD和GSH-Px活性明显升高(P<0.05,P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.05,P<0.01)；与DE和DG组相比，DEG大鼠血清中SOD和GSH-Px活性和MDA含量变化较DE、DG单独作用更为明显(P<0.01)。

Tab. 1 MDA content and SOD,GSH-Px activity changes of diabetic n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malonaldehyde；GSH-Px：Glutathione peroxidase
**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

2.2 各组大鼠血清中血糖和血脂含量变化的比较

由表2可知，与N组相比，D组大鼠血糖、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和胰岛素含量明显升高(P<0.05,P<0.01)，高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C)含量明显降低(P<0.05)，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)含量升高，但无显著性差异(P>0.05)；与D组相比，DE、DG和DEG组大鼠血清中血糖、TC、TG和胰岛素含量明显降低(P<0.05,P<0.01)，HDL-C含量明显上升(P<0.05,P<0.01)，DE和DG组LDL-C含量降低，但无显著性差异(P>0.05)，DEG组LDL-C含量明显降低(P<0.05)；与DE和DG组相比，DEG组大鼠血清中血糖、TC、TG、LDL-C和胰岛素、HDL-C含量含量变化较DE、DG单独作用变化更为明显(P<0.01)。

Tab. 2 Changes of blood glucose,blood lipid and insulin in diabetic n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group；TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；LDL-C：Low density lipoprotein-cholesterol；HDL-C：High density lipoprotein- cholesterol
*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

2.3 各组大鼠血清脂联素、瘦素和TNF-的变化

由表3可知，与N组相比，D组大鼠血清中脂联素水平明显降低(P<0.05)，瘦素和TNF-水平明显升高(P<0.05,P<0.01)；与D组相比，DE、DG和DEG组大鼠血清中脂联素水平明显升高(P<0.05,P<0.01)，瘦素和TNF-水平明显降低(P<0.05,P<0.01)；与DE和DG组相比，DEG组大鼠血清中脂联素，瘦素和TNF-水平变化较DE、DG单独作用变化更为明显(P<0.01)。

Tab. 3 Changes of serum adiponectin,leptin and tumor necrosis factor-(TNF-)in diabetic rats(ng/ml, n=10)

Tab. 3 Changes of serum adiponectin,leptin and tumor necrosis factor-(TNF-)in diabetic rats(ng/ml, n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

3 讨论

本实验采用STZ注射进行T2MD造模，成模后的D组大鼠的血糖和胰岛素水平较N组明显升高，表明塑模成功。研究表明糖脂代谢紊乱加重了糖尿病的氧化应激的程度[13]，从而引起下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能亢进，引起糖代谢紊乱，血糖升高，进一步造成机体损伤。机体氧化应激水平可以通过检测血浆SOD、GSH-Px活力以及MDA 含量来反映[14]。本研究结果表明，与N组大鼠相比，D组大鼠血清中SOD和GSH-Px活力明显下降，MDA含量明显升高，表明T2MD大鼠抗氧化防御体系受到抑制，易出现氧化应激损伤。大量研究表明，糖尿病患者糖脂代谢紊乱，从而导致动脉粥样硬化的发生[15]。本实验T2MD大鼠存在明显的糖脂代谢紊乱、氧化应激以及炎症情况，这与Wei等和Zeyda等的研究一致，即T2MD的发病与慢性炎症以及胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)关系密切[16]。现代研究表明，肥胖是引发IR和瘦素抵抗(leptin resistance，LR)的最重要因素，而IR和LR是T2MD等代谢性疾病的基础。目前的研究已经表明，脂联素与IR密切相关，并且很可能是一种新的代谢综合征标志物。本研究显示，T2MD大鼠血浆脂联素水平与血浆胰岛素呈负相关关系，再次证实脂联素与IR密切，但是脂联素与IR之间的机制还需进一步研究。Kubota认为，脂联素能有效提高胰岛素的敏感性，可能是由于胰岛素的敏感性与葡萄糖代谢的稳定需要脂联素进行正常调节[17]。近年来，TNF-α在T2MD相关疾病中的作用越来越受到重视。有研究表明，TNF-α可加速脂肪细胞的脂解，促使游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)从细胞溢出，参与肥胖及IR的发生[18]。本实验研究发现，T2MD大鼠TNF-α水平上升，说明其IR和炎症损伤的程度较高。以往研究表明，胰岛素不仅能够直接抑制炎症因子的生成，而且还能通过调节血糖浓度来间接发挥抗炎作用，缓解炎症损伤。但当T2MD伴随IR和LR时，TNF-α等炎症因子水平上升，由此可以认为IR和LR是一个炎症过程，这与本研究结果一致，故对T2MD肥胖患者治疗的关键是增强其胰岛素和瘦素的敏感性。本实验中T2MD大鼠糖脂代谢紊乱、IR和LR抵抗、氧化应激增强等都被认为直接或间接地诱导炎症因子表达的增加，这些因素的之间的交互作用可能进一步加剧机体多器官系统的炎症损伤，从而引起代谢改变综合征。

国内外研究表明，运动是防治T2MD的重要手段[19-20]。以往研究表明，有氧运动能改善IR，从而有效地控制T2MD[21]。本研究显示，进行6周的有氧运动能有效提高T2MD大鼠的抗氧化应激能力。本研究也发现，随着血糖水平的下降，TC和TG随之明显下降，HDL-C明显升高，可见血糖的控制程度的优劣对脂肪代谢能力有显著的影响；有氧运动能够改善糖脂代谢紊乱，可能是由于有氧运动使糖脂消耗增加，在运动后的超量恢复阶段，糖原合成酶的活性升高，使血液中的血糖迅速转移到肌肉中用于肌糖原的补充；运动引起交感神经兴奋性提高，使得血液胰岛素水平下降，体内脂肪分解增加，增加了脂肪作为能量的利用，降低TC含量；运动也增加了骨骼肌对游离脂肪酸的摄取和利用，使得TC分解代谢增强，浓度下降；同时，有氧运动又能够降低血液中LDL-C和提高HDL-C含量，从而改善T2MD导致的血管粥样硬化，减轻并发症的发生；运动训练还可以增强脂解酶的活性，即在肌肉收缩过程中不仅糖代谢紊乱得到改善，脂代谢也得到相应的改善。有氧运动后SOD、GSH-Px活性增强，MDA 含量降低，表明运动通过提高抗氧化酶的活性，改善T2MD大鼠的过氧化损伤、抑制氧化应激来提高防御能力。关于血清炎症因子TNF-α与运动的关系已有研究表明，长期系统的运动可以降低TNF-α，本次实验结果也表明，运动能降低T2MD大鼠TNF-α，从而减轻炎症反应。本研究表明，运动可明显增加抗炎因子脂联素的表达，这可能是由于运动能有效改善糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱，从而抑制TNF-ɑ和瘦素的产生。Hulve研究发现运动对脂联素水平的影响不大，且不能改善胰岛素的敏感性[22]。目前关于运动与脂联素的水平存在争议。本实验研究发现，有氧运动增加了脂联素的含量，但与D组比较没有显著性的差异，这可能与本实验的运动强度较低，持续时间相对较短有关，适当增加运动强度或者持续时间可能会显著提高脂联素。长期有氧运动极大地改善了T2MD大鼠糖脂代谢紊乱、IR、氧化应激的状况，从而直接或间接地抑制炎症因子表达的增加，减轻炎症反应。有研究认为，运动后骨骼肌细胞分泌大量IL-6，IL-6能够抑制TNF-α和IL-1β分泌，同时还能促进抗炎因子如IL-10 和IL-1的分泌。虽然认识到运动对缓解机体炎症有一定的作用，但其机制还需进一步的研究。

机体处于应激状况以及高分解代谢疾病状态下(比如糖尿病)，血浆中游离Gln含量迅速下降甚至耗竭，导致机体产生氧化应激损伤，同时细胞免疫能力下降。研究表明，外源性补充Gln后可明显缓解上述情况，因此已被广泛用做营养补充剂以及多种临床疾病的治疗[23]。T2MD患者体内Gln明显减少，给予T2MD患者外源性Gln补充不仅可提高机体的抗氧化能力。本研究结果显示，补充Gln可明显地提高T2MD大鼠抗氧化应激作用，改善T2MD 大鼠血糖代谢紊乱的情况，有效降低T2MD大鼠瘦素和TNF-的表达，减轻大鼠的炎症性损伤。

脂肪组织是循环血液中TNF-α的主要来源，长期规律的有氧运动可以改善身体成分，减少脂肪细胞分泌TNF-α；Opara的研究表明补充Gln会使高脂膳食小鼠体重下降的同时改善IR[24]；然而Bock的研究报道指出，补充Gln并不能有效的改善小鼠的体重以及IR状态[25]。因此，Gln是否能改善糖尿病大鼠体重的增加和IR的作用还存在争议。本研究表明，Gln干预后大鼠体重下降，IR改善，且二者联合干预效果更好。T2MD机体Gln水平降低，及时的补充且伴随有氧运动有效地改善糖脂的代谢以及全身的血液循环，使得机体获取更多的能源底物，增加抗氧化物质的合成，改善血脂代谢紊乱以及炎症因子和抗炎因子的失衡有关。有氧运动组和Gln组大鼠胰岛素、瘦素水平显著下降，脂联素水平上升，且两者联合干预效果更显著，从而提示有氧运动和Gln均能调节胰岛素和瘦素水平，改善IR 和LR，增强胰岛素和瘦素的敏感性，提高脂联素水平。

综上所述，改善糖脂代谢、减轻氧化应激以及慢性炎性已经成为T2MD的治疗靶标，补充Gln和有氧运动均可以改善T2MD大鼠糖脂代谢、胰岛素敏感性，减轻氧化应激损伤，降低炎性因子应答能力，且两者联合作用效果更好，但其确切机制有待进一步深入研究。