缺氧缺糖诱导心肌细胞损伤中Notch信号对HIF-α及自噬相关基因Beclin1，LC3I，LC3II表达的影响*

孔令宇，席 錾，马文婷，杨飞云，牛丽丹，石金河△

(1.新乡医学院第一附属医院急诊科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院儿外科，河南 卫辉 453100；3.新乡医学院三全学院诊断学实验室，河南 新乡 453003)

Notch基因是1917年Morgan及其同事在果蝇中发现的一个高度保守的基因家族，编码四个跨膜受体，即Notch，Notch2，Notch3和Notch4，参与了细胞的生长、增殖、分化以及器官的发育等[1,2]。近年来的研究显示，Notch信号通路在心血管系统的发生，发展，生理及病理过程中均发挥着重要作用。但是，Notch信号通路参与心肌保护作用的分子机制并不十分明确。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可通过调节多种因子而参与对心脏的保护作用[3]，在对心肌细胞的保护作用中，Notch信号通路与HIF-1之间是否有关联还不得而知。本研究以H9C2细胞为研究对象，检测缺氧缺糖模型中，Notch信号通路与HIF-1α及自噬之间的关系，将为临床心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

大鼠心肌细胞H9C2 细胞株购自于协和细胞库。

1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清购自于美国Sigma公司，Notch1 siRNA,HIF-1α siRNA及阴性对照(Negative control，NC)siRNA购自于SANTA Cruz公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自于美国Invitrogen公司。Notch1抗体，HIF-1α抗体购自于SANTA Cruz公司，LC3I抗体,LC3II抗体购自于abcam公司，GAPDH抗体，β-actin抗体购自于Sigma公司，荧光II抗购自于LI-COR公司。

1.3 H9C2的培养

H9C2细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中(含100 U/ml 青霉素及0.1 mg/ml链霉素)，置于37℃、5 % CO2的恒温培养箱中，2～3 d传代1次，实验所用细胞均为对数生长期细胞。

1.4 缺氧缺糖细胞模型的建立

将H9C2细胞正常培养(37℃、5 % CO2的恒温培养)24 h后，更换成不含血清的低糖DMEM培养基低氧条件下(1%O2、95% N2、5% CO2)培养24 h。

1.5 心肌细胞转染

按照Lipofectamine 2000转染试剂的使用说明，利用Lipofectamine 2000转染试剂分别将Notch1 siRNA,HIF-1α siRNA与NC siRNA转染至H9C2细胞。

1.6 实验细胞分组

正常对照组，缺氧缺糖组(OGD group)，缺氧缺糖+ NC siRNA组(转染NC siRNA后缺氧缺糖条件培养24 h)，缺氧缺糖+ Notch1 siRNA组(转染Notch1 siRNA后缺氧缺糖条件培养24 h)，缺氧缺糖+ HIF-1α siRNA组(转染HIF-1α siRNA后缺氧缺糖条件培养24 h)。

1.7 心肌细胞活性的检测

将H9C2按照5×103cells/well的密度接种于96孔板中，按照上述方法将细胞分为5组，在缺氧缺糖诱导24 h后检测各组活性，每孔加入10 μl CCK-8溶液，正常培养条件下继续孵育2～4 h，酶标仪450 nm处测OD(A)值。

1.8 Western blot

收集上述5组细胞,利用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。常规SDS-PAGE电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Notch1抗体(1∶500)，HIF-1α抗体(1∶1 000)，Beclin1抗体(1∶500)，LC3I抗体(1∶500)，LC3II(1∶500)及β-actin抗体(1∶ 5 000),GAPDH抗体(1∶10 000)4℃孵育过夜，荧光II抗(1∶1 000)室温孵育2 h后，Odyssey曝光，Image J软件分析灰度值。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA对Notch1及HIF-1α表达的影响

为了检测OGD模型中Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA的干扰效果，本文利用Western blot 检测转染Notch1 siRNA，HIF-1α siRNA 24 h后模型中H9C2细胞中Notch1，HIF-1α的表达情况。结果显示，与阴性对照组(NC siRNA group)相比较，转染Notch1 siRNA 24 h后，H9C2心肌细胞中Notch1的表达显著降低(P<0.01)，同时HIF-1α的表达显著降低(P<0.05，图1，表1)；转染HIF-1α siRNA 24 h后，H9C2细胞中HIF-1α的表达也显著降低(P<0.01,图2)，而阴性对照组与模型对照组相比并无明显差别。结果提示，Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA均具有较好的干扰效果，抑制 H9C2细胞中Notch1的激活可进一步抑制HIF-1α的产生。

Fig.1Effects of Notch1 siRNA on the expressions of Notch1 and HIF-1α detected by Western blot
1:Normal group;2:NC group;3:Notch1 siRNA group;HIF-1α:Hypoxic induction factor-1α

Tab. 1 Effects of Notch1 siRNA on the expressions of Notch1 and HIF-1α detected by Western blot

*P<0.05，**P<0.01vsNC group

Fig.2Western blot test was used to detect the interference effect of HIF-1α siRNA
1:Normal group;2:Negative control(NC)group;3:HIF-1α siRNA group
**P<0.01vsNC group

2.2 各组心肌细胞活性

CCK-8实验结果如表2所示，与正常对照组相比较，缺氧缺糖组细胞的活性显著降低(P<0.01)；而与缺氧缺糖组相比较，转染Notch1 siRNA及HIF-1α siRNA后，两组细胞的活性进一步降低(P<0.01,P<0.01)。如图1所示，抑制H9C2细胞中Notch1的激活可进一步抑制HIF-1α的产生，而转染Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA的两组细胞的活性统计学分析并没有明显的差别(P>0.05)，这就提示在缺氧缺糖情况下，Notch1信号的激活可促进对模型细胞中HIF-1α的产生，从而对模型细胞起到一定的保护作用。

2.3 各组细胞中Beclin1，LC3I，LC3II 蛋白的表达变化

结果如图3所示，与正常对照组相比较，缺氧缺糖组细胞中Beclin1，LC3I，LC3II蛋白的表达均显著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；而与缺氧缺糖组相比较，转染Notch1 siRNA后，细胞中Beclin1mRNA的表达显著降低(P<0.01)，LC3I与LC3II 蛋白的表达均显著降低(P<0.01，P<0.01)，LC3II/LC3I的比率显著降低；转染HIF-1α siRNA后，细胞中Beclin1蛋白的表达显著降低(P<0.01)，LC3I与LC3II蛋白的表达均显著降低(P<0.01，P<0.01)，LC3II/LC3I的比率显著降低，而转染Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA的两组细胞相比较Beclin1，LC3I与LC3II蛋白的表达变化，统计学分析并没有明显的差别，这些结果提示Notch1通过促进HIF-1α的表达，进一步通过增强自噬对缺氧缺糖的心肌细胞起到一定的保护作用，抑制Notch1可抑制HIF-1α的产生进一步干扰自噬途径，从而促进心肌细胞损伤。

Tab. 2 Activity of cells in each group was detected by CCK-8 assay

1:Normal group;2:OGD group;3:OGD group+NC siRNA group;4:OGD group+Notch1 siRNA group;5:OGD group+HIF-1α siRNA group;OGD:Oxygen-glucose deprivation
**P<0.01vsOGD group

Fig.3The expressions of Beclin1,LC3 I and LC3 II protein were detected by Western blot in each group
1:Normal group;2:OGD group;3:OGD group+NC siRNA group;4:OGD group+Notch1 siRNA group;5:OGD group+HIF-1α siRNA group

3 讨论

本文首次研究了Notch信号通路的激活与HIF-1α的产生及心肌细胞自噬之间的关联，缺氧缺糖条件下抑制Notch信号中Notch1的表达，可抑制HIF-1α的产生，进而抑制缺氧缺糖心肌细胞的自噬，从而促进心肌细胞损伤，因而，Notch1通过促进HIF-1α的表达，增强自噬，对缺氧缺糖的心肌细胞起到一定的保护作用。

心肌梗死是当前临床上常见的缺血性心脏病的主要类型之一[4]，严重威胁着人们生命。近年来，Notch信号通路在心肌细胞保护中的作用越来越受到研究者们的注意。丹参酮ⅡA可通过抑制Notch信号通路的活化及调节心肌细胞凋亡而在乳鼠心肌细胞I/R损伤中起到保护作用[5]。Notch 信号途径对心肌细胞具有的保护作用可能与抑制ROS的水平有关[6]。Notch3/Akt信号通路可增强抑瘤素M对缺血/再灌注心肌细胞的保护作用[7]，Notch1信号可对烧伤引起的心肌细胞损伤起到保护作用[8]。Notch1参与调节人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的转化[9]。microRNA-99a通过激活H9C2心肌细胞中的Notch通路来降低脂多糖对心肌细胞的氧化损伤[10]。

HIF-1是急性心肌梗死后心脏适应性变化过程中的主要调节因子之一，其可通过调节多种因子，如血管内皮生长因子等调节心肌细胞，血管内皮细胞和平滑肌细胞等，从而参与对心脏的保护作用[3,11]。Przyklenk K等人的研究结果显示，心肌缺血缺氧时，可通过诱发自噬而发挥对心肌细胞的保护作用[12]，而自噬抑制剂抑制自噬后导致缺氧诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡增加,且HIF-1参与缺氧诱导的自噬抵抗凋亡发挥心肌保护作用[13]。然而，在缺氧缺糖条件下，Notch信号通路的激活与HIF-1α的产生及心肌细胞自噬之间是否存在关联，还未见报道。

本实验中的结果显示，利用OGD模型，转染HIF-1α siRNA,Notch1 siRNA至心肌细胞后，HIF-1α siRNA可有效敲低模型心肌细胞HIF-1α的表达，而Notch1 siRNA可有效敲低模型心肌细胞中Notch1与HIF-1α的表达；与OGD组细胞相比较 Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA可进一步降低OGD模型中心肌细胞的活性，且二者之间没有统计学差异；Beclin1及LC3II/LC3I的比率与自噬密切相关，当自噬途径被损坏后，Beclin1的表达降低，同时LC3II/LC3I的比率也降低[14]，进一步我们发现Notch1 siRNA与HIF-1α siRNA可降低模型细胞中自噬相关的基因Beclin1，LC3I，LC3II的表达，降低LC3II/LC3I的比率。

综上所述，Notch1信号的激活可促进HIF-1α的产生，HIF-1α可通过诱导心肌细胞自噬而发挥细胞保护作用，抑制Notch1的表达后，可减少自噬途径，进一步引起心肌细胞的损伤，Notch1通过调节模型细胞HIF-1α的表达促进缺氧缺糖诱导的自噬而发挥心肌保护作用。本研究探讨了Notch信号通路与HIF-1α及自噬之间的关系，将为临床心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考。