DIO基因多态性与有氧耐力的相关性研究*

周文婷，胡 扬

(1.遵义师范学院，贵州 遵义 563000；2.哈尔滨体育学院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.北京体育大学，北京100084)

甲状腺激素(thyroxine,TH)由甲状腺分泌，主要有T4和T3两种。此外，甲状腺也可分泌极少量无活性的逆-T3(rT3)。TH功能广泛，可影响个体的生长、发育、组织分化，调节物质能量代谢[1]，维持正常的心血管功能[2]和肌肉系统活性[3]，调节多种骨骼肌功能相关基因的转录[4]并对个体的运动耐受性起维持作用[5]，其水平及活性的高低与个体的有氧耐力水平息息相关。研究发现，TH特别是T4的产生由下丘脑-垂体-甲状腺轴控制；TH的功能，尤其是T3功能则主要由组织内的碘代甲状腺氨酸脱碘酶(iodothyronine deiodinase,DIO)与TH转运体调控[6]。研究发现，运动可直接或间接影响甲状腺功能，此外，还可引起下丘脑-垂体-甲状腺轴功能的急剧改变，或导致运动员甲状腺功能的长期改变，而运动员甲状腺功能的改变被认为是一种耐受能力的适应性机制，该机制可使能量的摄取和消耗趋于平衡[7]。

研究发现，几个TH路径基因的基因多态性可改变TH的活性。其中，一些多态位点不仅与常人血清中的TH水平有关，也与某些TH相关疾病有关，其中DIO1和DIO2基因研究较多[8-10]。DIO1表达于肝脏、肾脏和甲状腺，可激活T4成为有活性的T3，与清除代谢物rT3的过程亦相关[8]。DIO2表达于脑、垂体、甲状腺、骨骼肌、动脉平滑肌和心脏等，在某些组织如大脑中，DIO2作用于T3在组织局部的产生，在骨骼肌中，DIO2则是血浆内T3的主要来源[6]。一般认为，T3/rT3比率是TH外周代谢的敏感指标，其水平不受T4产生和血清中结合蛋白变化的影响，DIO1和DIO2对其发挥正调节作用[9]。目前，尚没有对DIO基因多态性与运动能力相关的报道。但DIO1基因的C785T位点及DIO2基因的Thr92Ala和Gly3Asp位点因可能影响血清TH水平而被广泛研究[8-10]。因此本研究选择这3个多态位点为研究对象，通过对比优秀耐力运动员(elite endurance athlete,EEA)与普通对照人群(control group,CG)中上述基因多态的分布特征，探讨其作为影响有氧耐力素质的分子遗传学标记的可能性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

中国北方汉族优秀长跑运动员123人，其中男性62人，女性61人。运动专项分别为5/10 km或马拉松组(92vs31)，运动等级为健将或国际健将组(80vs43)，其中5/10 km和马拉松组各包括男、女运动员47人、45人和15人、16人，健将及国际健将组各包括男、女运动员51人、29人和11人、32人。中国北方汉族普通大学生(control group,CG)127人，其中男性56人，女性71人，均未经任何专业训练，且其父母均无专业运动员背景，正常参加体育活动，体检合格。所有受试者均为汉族，其双亲、祖辈双亲也均为汉族，籍贯均为我国东北三省、华北五省、河南、山东及安徽北部，均知情同意，基本情况见表1。

Tab. 1 Characteristics of the elite endurance athletes and the control group

1.2 静脉取血

常规方法取外周静脉血并用基因组DNA纯化试剂盒(Promega)从全血中提取基因组 DNA。

1.3 多态位点检测

根据文献研究报道[8-10]和SNP数据库资料，通过HapMap和Haploview软件分析，选取3个SNP位点：DIO1基因的C785T位点、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点。

SNP分型由Sequenom公司的Mass ARRAY系统完成。用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF)，引物延伸的方法进行多态位点解析，分析委托公司完成(上海邃志)。

PCR引物和单碱基延伸引物均由Assay Designer(Sequenom)软件包设计。PCR扩增目的片段，针对SNP的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应。将终止反应物脱盐后点样到spectro CHIP上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由 Mass ARRAY RT软件系统(版本号 3.0.0.4)实时读取，并由Mass ARRAY Typer软件系统(版本号 3.4)完成基因分型分析。

PCR反应体系为：DNA样本1 μl(5 ng/μl)；PCR引物1 μl；dNTP 1 μl(2.5 mmol/L)；MgCl20.325 μl(25 mmol/L)；HotStar Taq酶 0.1 μl；PCR缓冲液0.625 μl；H2O 0.95 μl。PCR反应条件：94℃ 15 min；94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共45个循环；最终72℃ 3 min。

PCR扩增后，剩余的dNTP被去磷酸。反应体系为：H2O 1.53 μl；SAP缓冲液0.17 μl；碱性磷酸酶(Sequenom)0.3 U。反应条件：37℃ 40 min，85℃ 5 min。

单碱基延伸反应体系为：H2O 0.755 μl；10×iPLEX缓冲液0.2 μl；终止混合物0.2 μl、iPLEX酶0.041 μl；延伸引物0.804 μl(10 μmol/L)。单碱基延伸反应条件：94℃ 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，共40个循环；最后72℃ 3 min。

1.4 统计学处理

本实验数据统计分析由SPSS 13.0和SHEsis在线软件[11]完成。对每个位点进行等位基因频率、基因型频率统计，并对EEA组和CG组进行H-W平衡检测。单个SNP在EEA组和CG组分布频率的差异采用χ2检验，通过Shesis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)计算同一基因不同位点间(DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点)的D'和r2，以测量对应位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)紧密程度，并计算单体型频率[12,13]。

2 结果

2.1 基因型和等位基因分布特征分析

DIO1基因的C785T位点、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点的基因型分型成功率在EEA组和CG组分别为100%和100%、99.2%和99.2%及99.2%和100%。

EEA组和CG组在上述多态位点的等位基因和基因型频率均符合H-W平衡(P>0.05)，表明本研究的各组研究对象均具有群体代表性。

DIO1基因的C785T位点、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点基因型和等位基因分布频率分别见表2、表3及表4。结果显示，将EEA组和CG组按不同性别分组，在DIO1的C785T位点、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点，各组间基因型和等位基因频率均无显著性差异(P>0.05)，表明在上述位点，基因型和等位基因的分布无性别差异。(此处在实验设计时考虑的是先比较不同性别组中的差异，如果有性别差异，则继续比较不同性别各组间的差异，如果无性别差异，则仅用CG数据即表2中第一行127人的基因型与等位基因分布与EEA组的各组比较，以获得普通人与不同运动等级、运动项目长跑运动员间各多态位点的分布差异，也就是下一段文字的内容)。

将EEA组按运动项目和运动等级进行分组并与CG组(127人总体)进行比较，结果发现，在DIO2基因的Gly3Asp位点，基因型在CG组与国际健将组(χ2=5.97，P=0.05)、CG组与马拉松组(χ2= 8.45，P=0.01)间的分布均差异显著，但各组间的等位基因分布频率差异均不显著。在DIO1基因的C785T位点及DIO2基因的Thr92Ala位点，各组间的基因型和等位基因频率没有显著性差异(P>0.05，表2，表3，表4)。

Tab. 2 Distribution of genotype and allele frequencies of C785T polymorphism in DIO1 gene

Tab. 3 Distribution of genotype and allele frequencies of Thr92Ala polymorphism in DIO2 gene

Tab. 4 Distribution of genotype and allele frequencies of Gly3Asp polymorphism in DIO2 gene

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol group

2.2 连锁不平衡和单体型分析

对DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点进行D'和r2计算，结果显示，两个位点处于强连锁不平衡状态(D'=0.900，r2=0.133)，形成了4个单体型CC、CT、TC及TT(所有频率小于 0.03 的基因型都被忽略)。其中将EEA组和CG组间按不同性别分组，结果发现，在男CG组与女CG组及男CG组与男EEA组间，CT单体型的分布均差异显著(χ2= 4.03，P=0.04及χ2=4.23，P=0.04，表5)。

Tab. 5 Distribution of haplotype frequencies of DIO2 gene in EEA and CG

*P<0.05vsmale control group

将不同性别运动员按运动项目和运动等级进行分组并与相应性别的CG组进行比较，结果发现，CT单体型在男CG组与男健将组、男CG组与男马拉松组间的分布均有显著性差异(χ2=4.96，P=0.03和χ2=6.52，P=0.01)，TC单体型则在女CG组与女国际健将组、女CG组与女5/10 km组间的分布差异显著(χ2=4.98，P=0.03和χ2=3.82，P=0.05，表6)。

3 讨论

不同人的血浆TH水平差异显著，表明环境因素外，遗传因素对TH功能调节也可能具有潜在影响[14]。双生子研究发现，遗传因素与血清中游离T4(free T4,FT4)和游离T3(free T3,FT3)约65%的变化量有关[15]；另一项关于墨西哥-美国人的研究则发现，个体间血清TH含量26%～64%的变化由遗传决定[16]。

人DIO1基因位于染色体1p33-p32，长度约 17.5 kb，由4个外显子和3个内含子组成，编码250个氨基酸，分子量为28.7 kD。Peeters等于2003年发表了一项研究，报道了两个影响健康人血清T3/rT3比率的DIO1多态位点C785T和A1814G[8]。研究发现，等位基因785T与较高的rT3水平和较低的T3/rT3比率有关，而1814G与较高的T3/rT3比率有关，故推测等位基因785T与1814G会分别导致DIO1活性的下降和上升。由于它们均位于mRNA的3’UTR，研究者推测这两个突变改变了mRNA的稳定性或折叠[8]。由于该折叠处于硒代半胱氨酸的插入序列中，而该序列可影响蛋白质与硒代半胱氨酸残基的结合，对该基因在编码区或调控区内与其他多态基因的连锁亦有显著影响，故该折叠的改变可导致DIO1的活性发生变化[6]。

人DIO2基因位于染色体14q24.3，基因全长15 kb，由2个外显子和1个内含子组成。Thr92Ala位点是首个被研究的DIO2多态位点[17]，虽然它并不影响血清中的T3水平，却与三个不同人群中胰岛素抵抗的发生有关，推测这可能是骨骼肌和/或脂肪中DIO2的活性降低的结果，即在对胰岛素较敏感的组织，如脂肪组织和骨骼肌中，DIO2活性的下降会降低组织局部的T3活性，从而表现与胰岛素抵抗间的关联[9]。鉴于此推测，Peeters等研究分别转染92Thr和92Ala的不同细胞的DIO2活性，结果不同细胞间未见差别[8]；而Canani等在研究中却发现，DIO2的活性在表达92Ala等位基因的肌肉和甲状腺匀浆混合物中较低[18]，进而推测该位点的作用是它与其他多态位点间存在连锁的结果。近期，研究发现DIO2的Gly3Asp多态位点与年轻人血清T3/T4比率呈现相关[19]，且与Thr92Ala位点分处于不同的单体型等位基因中[10]。

Tab. 6 Distribution of haplotype frequencies of DIO2 gene in EEA and CG of different genders

*P<0.05vsmale control group;#P<0.05vsfemale control group

本研究通过比较不同多态位点在普通汉族人与优秀长跑运动员中的分布频率差异，首次探讨了DIO1和DIO2基因SNPs与有氧耐力之间可能的关联性。结果发现，在DIO2基因的Gly3Asp位点，基因型在CG组与国际健将组、CG组与马拉松组间的分布均差异显著，其中TT基因型仅存在于EEA组，但等位基因的分布频率在CG组与EEA组中差异不显著。因TT基因型在EEA组频率很低，国际健将组为5%，马拉松组为3%，因此，该位点尚无法作为预测中国北方地区汉族人群杰出有氧耐力素质的分子标记，需要增加样本量进一步加以确认。

对DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位点进行单体型分析后发现，二者处于强连锁不平衡，形成了4个单体型CC、CT、TC及TT。其中，将EEA组和CG组按不同性别分组，结果发现，在男CG组与女CG组及男CG组与男EEA组间，CT单体型的分布均差异显著，表明CT单体型的分布具有性别差异，且该单体型是男子优秀运动员有氧耐力素质的分子标记。将不同性别运动员按运动项目和运动等级进行分组并与相应性别的CG组进行比较，结果发现，CT单体型在男CG组与男健将组、男CG组与男马拉松组间的分布均有显著性差异，TC单体型在女CG组与女国际健将组、女CG组与女5/10 km组间的分布差异显著，表明CT单体型和TC单体型的分布分别在不同等级、不同项目的男、女运动员间差异显著，可分别作为男子健将级运动员和马拉松运动员以及女子国际健将运动员和5/10 km运动员有氧耐力素质的分子标记。

此外，本研究发现中国北方汉族人群中DIO1基因C785T位点、DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位点多态性存在种族差异。以上3个多态位点的基因型和等位基因分布频率与欧美人之间差异均非常显著(P<0.01)：在欧美人群中，DIO1基因C785T位点的基因型分布频率分别为CC(41%)、CT(46%)和TT(13%)[20]，本研究中发现的基因型分布频率则分别为CC(76%)、CT(20%)和TT(3%)；在荷兰人中[20]，Thr92Ala位点的基因型频率分别为CC(39%)、CT(47%)和TT(14%)，在丹麦人中基因型频率分别为CC(41%)、CT(46%)和TT(12%)[8]，本研究中发现的基因型分布频率则分别为CC(17%)、CT(56%)和CT(27%)；在Gly3Asp位点，基因型频率在荷兰人中分别为CC(42.7%)、CT(44.4%)和TT(12.9%)[18]，本研究中发现的基因型分布频率则分别为CC(67%)、CT(23%)和TT(10%)，说明人种差异可能是本研究与国外的研究结果不尽相同的原因。因这种人种和地域上的差异可能是种族进化、人类迁移及自然淘汰的结果，所以这种差异造成的基因多态分布特征不同可能形成不同的关联结果。

综上所述，DIO1基因C785T位点、DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位点多态性单独均与中国北方地区汉族人群杰出有氧运动素质无关，但DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位点单体型CT是男子优秀运动员有氧耐力素质的分子标记，可用于男子长跑健将级运动员及马拉松运动员的分子选材，TC单体型则是女子长跑国际健将运动员和5/10 km运动员有氧耐力素质的分子标记。