网箱养殖大黄鱼内脏白点病的早期干预效果分析

孙敏秋

(福建省水产技术推广总站，福建 福州 350002)

大黄鱼内脏白点病又称内脏结节病，是近年来养殖大黄鱼(Larimichthyscrocea)的主要病害，在各个大黄鱼养殖地区均广泛流行。一旦发病，累计死亡率可达50%以上，严重影响了大黄鱼的养殖产量。近些年，针对该病的研究主要集中在病原的分离鉴定、组织病理学及致病机理[1-2]等方面。已确定大黄鱼内脏白点病的病原为假单胞菌，一些研究认为是其中的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[3-7]，另一些报道则认为是恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)[1,8-9]。研究表明：该病临床症状主要体现在患鱼的肝脏、肾脏、脾脏等内脏有大量肉眼可见白色结节[10]。该病的发生与水温变化密切相关[11]。许斌福等[12]对大黄鱼内脏白点病的流行病学调查研究发现，在宁德地区，内脏白点病主要在每年10月初至次年5月的低温期流行，其中，3月初至4月中下旬(水温14～18℃)为发病高峰期，主要危害50～150 g的网箱养殖大黄鱼。以往的研究虽已提出一些防治该病的初步建议[6,13]，但出现结节后药物治疗效果不佳。本研究旨在通过流行病学观察，在确定大黄鱼内脏白点病病原和敏感药物的基础上，在发病早期通过药物干预治疗，以期达到提高治愈率的目的。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

2018年1月分别在福建省宁德市三都澳的大湾海区渔排(以下简称渔排1)和官井洋海区渔排(以下简称渔排2)开展早期治疗试验。其中，渔排1的试验大黄鱼规格为75～100 g，共计45 000尾；渔排2的试验大黄鱼规格为60～100 g，共计213 000尾。

1.2 样品采集

试验期间，除记录试验大黄鱼的发病和死亡情况数据外，在2月、4月及5月，分别从2个渔排的6个网箱中进行随机采样和解剖观察，每个样品采集5～10尾。

1.3 解剖观察内脏白点出现情况

用无菌手术剪剖检样品鱼体腹部，观察脾脏、肾脏甚至肝脏有无大量白点或白色结节，并统计每个样品出现内脏白点症状的概率：

内脏白点出现率/%=患内脏白点症状的鱼尾数/每个样品采集的鱼尾数×100%

1.4 细菌的分离与培养

全程无菌操作，用接种环从样品鱼的肝、肾、脾等部位取样划线分离至TSA(1% NaCl)和TCBS平板培养基，于(28±2)℃恒温培养24 h，挑取优势单菌落若干个进行再划线分离纯化培养。

1.5 分离菌的鉴定

1.5.1 形态学观察

分离纯化后接种于TSA(1% NaCl)和TCBS平板，(28±2)℃恒温培养24 h，此时观察菌落颜色、形态、透明度等菌落特征。

1.5.2 分离菌株的16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA特异性通用引物进行PCR扩增(目标片段约1 500 bp)，上游引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物P2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(上海生工生物工程公司合成)。提纯分离菌基因组DNA作为PCR模板，PCR反应体系为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min ，30个循环，72℃延伸10 min。反应后各取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。阳性克隆菌液送去测序(上海尚亚生物技术有限公司)，所得序列通过软件NCBI BLAST进行比对分析。

1.6 药物敏感试验

1.6.1 供试药物

选择的供试药物均为目前我国农业农村部以及国外允许使用的水产用抗菌药物。所有实验室内使用的药物均由全国水产技术推广总站提供。

1.6.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定

参照《水生动物致病菌药敏试验操作规程》，采用液体培养基稀释法，全程无菌条件下，将供试药物浓度配制成200 μg/mL的最高测定浓度(前期工作中的病原菌耐药性普查试验的最高测定浓度为1 024 μg/mL)，再用TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养基按2n倍比依次稀释成11个浓度梯度，另设1个空白对照组，后依次接入1∶1体积的浓度为106cfu/mL的待测菌悬液，于(28±2)℃恒温培养箱中培养24 h，每种供试药物做2个平行，观察实验结果。

1.7 治疗

在2— 4月的3个月间检出致病菌后，根据细菌分离和药敏试验结果，选择盐酸恩诺沙星、盐酸土霉素口服开展治疗试验。2个海区的渔排各设置3个试验网箱，依次为盐酸恩诺沙星药物试验组、盐酸土霉素药物试验组和空白对照组。

按饲料量0.3%将药物溶解于水，均匀泼洒至颗粒饵料表面，静置吸收后投喂。连续给药5 d，试验组其余时间及空白对照组全程投喂未拌药物的相同饵料。

2 结果与分析

2.1 病原菌耐药性普查

在2016年的低温期间，分别在宁德蕉城、福安、福鼎、霞浦等地采集患内脏白点病的大黄鱼，从其肝、肾、脾等器官共分离获得大黄鱼源假单胞菌21株。通过开展13种抗菌药物敏感试验，测得21株大黄鱼源假单胞菌的MIC值(表1)，根据国家兽药标准，进而筛选获得大黄鱼源假单胞菌对盐酸多西环素、盐酸土霉素和盐酸恩诺沙星的敏感性均较高。

表1 21株大黄鱼源假单胞菌对13种抗菌药物的敏感性

注：“﹡”为部分数据省略。

Note：﹡indicated partial data omitted.

2.2 病原菌的分离鉴定

2月采集的大黄鱼样品经菌株分离和病原菌鉴定分析，获得6株大黄鱼源假单胞菌(Pseudomonasspp.)(表2)。

①注意卡管。在钻孔回扩完成后，如孔内石碴未清理干净，易在铺管过程中发生卡管情况，影响施工进度。因此对有断层或破碎带的钻孔必须认真细致冲洗，且冲洗完成后即组织铺管施工，不得停顿时间过长，避免卡管。

表2 分离菌株信息表

2.3 药物敏感试验

通过测定该6株假单胞菌对13种抗菌药物的敏感性，测得药敏结果(表3)与前期大黄鱼源假单胞菌耐药性普查结果基本一致，进一步验证这6株菌为大黄鱼源假单胞菌。

2.4 早期治疗效果

2.4.1 发病情况和死亡率

至6月30日止，渔排1的盐酸恩诺沙星组、盐酸土霉素组的大黄鱼基本未发生内脏白点病，各组死亡率也仅是正常损耗率，而空白对照组大黄鱼因该病的死亡率达6.00%；渔排2的盐酸恩诺沙星组也未有内脏白点现象，盐酸土霉素组则偶尔有零星内脏小白点发生，但基本无该病造成的死亡，而空白对照组因该病的死亡率达到7.00%(表4)。

表4 各试验组大黄鱼因内脏白点病导致的死亡率

2.4.2 解剖症状观察

解剖观察2月(用药前)、4月(用药期间)和5月(停药后)分别从渔排6个网箱采集的大黄鱼，解剖结果如表5所示，用药后，2个渔排的盐酸恩诺沙星组和盐酸土霉素组的大黄鱼均未见到内脏白点现象，但在4月渔排2和5月2个渔排的空白对照组的大黄鱼中均观察到不同程度的内脏白点现象，计算其内脏白点出现率分别为66.7%、25.0%和50.0%。

表5 解剖观察结果

注：“—”表示解剖未观察到内脏白点现象(内脏白点出现率为0%)。

Note：—indicated no visceral white spots(occurrence rate of visceral white spots was 0%).

3 结论与讨论

目前，大黄鱼内脏白点病的治疗普遍存在滞后性，即鱼体出现白点或结节症状后才开始用药，导致治疗效果不甚理想。本研究根据前期大黄鱼内脏白点病流行病学调查和病原菌耐药性普查结果，确定盐酸土霉素和盐酸恩诺沙星两种针对大黄鱼源假单胞菌的敏感性药物(由于盐酸多西环素与盐酸土霉素均属四环素类药物，两者具有相似的抗菌谱，综合考虑选择了盐酸土霉素)，预计一旦发现鱼体感染了假单胞菌，就立刻开展药物干预治疗试验，并跟踪分析治疗效果。试验证明，在鱼体感染了致病的假单胞菌，但还未形成内脏结节时，即刻开展口服盐酸恩诺沙星和盐酸土霉素的治疗，会显著降低大黄鱼内脏白点病的发病率及因该病导致的死亡率，达到了提高治愈率的目的。且从总体试验结果来看，盐酸恩诺沙星对大黄鱼源假单胞菌的抑制作用较盐酸土霉素会更明显。综上所述，治疗时间应是提高大黄鱼内脏白点病治愈率的关键因素，即把握药物治疗时间，开展早期干预对有效控制该病的病情具有重要意义。但在此需要注意的是，在使用抗菌药物治疗控制大黄鱼内脏白点病的同时，应严格遵循休药期规定，例如盐酸恩诺沙星的休药期一般为500度日，以确保水产品的质量安全。