乌贼墨黑色素粗提物的提取工艺优化及其抗氧化能力测定

何 健，刘 娥，李小娟，陆泽焱，廖祖华，戴金玉，高益槐

[安发(福建)生物科技有限公司，福建省天然生物活性物质企业重点实验室，福建 宁德 352100]

本文研究对象为头足类海洋生物(鱿鱼、乌贼、章鱼等)的墨囊中的黑色素，属于一种典型的以5，6-二羟基吲哚(DHI)和5，6-二羟基吲哚酸(DHICA)为前体的真黑色素[1]。此黑色素来源于头足类动物的墨汁中，故定名为墨黑色素。中国乌贼种类较多，东海盛产曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni)，分布于浙江南部沿海及福建沿海[2]。乌贼墨囊约占个体质量的1.3%，在产品加工过程中其大多被作为废弃物，这不仅是对资源的浪费，而且对环境水质造成破坏。黄伟卿等[3]对曼氏无针乌贼墨的营养成分分析发现，粗蛋白、粗脂肪和粗多糖分别占11.82%、1.53%和1.56%，还含有氨基酸、无机盐等丰富的营养成分。试验研究表明，墨黑色素具有光保护、清除自由基、抗氧化、抗肿瘤等生物活性[4-8]。

目前黑色素的制备方法主要有酸水解法、碱水解法、水洗法、高速离心法及酶解法，其中酸解、碱解的反应剧烈，对墨黑色素的结构和活性破坏大；水洗、高速离心只能去除水溶性组分，墨黑色素纯度不高，水溶性差[9]；酶解法由于反应条件温和，对墨黑色素生物活性物质破坏较小，能有效分离与墨黑色素结合的蛋白质、多糖等物质，同时随着近年来酶制剂的迅猛发展，因此其在工业中得到更广泛的应用[10]。而超声处理可对黑色素的物理结构进行破坏，电镜结果显示黑色素微球颗粒在超声处理后形成了更细小的碎片和碎末[11]，会更有利于酶解反应充分快速进行。因此，本试验以乌贼墨粉的水解度为考察指标，采用超声波辅助蛋白酶水解乌贼墨粉，筛选水解效果好的蛋白酶，同时通过单因素和正交试验对水解条件进行优化，确定最适反应pH、加酶量、反应温度、反应时间、固液比，并对制得的水解后墨黑色素进行2，3，5-三羧酸吡咯(Pyrrole-2，3，5-tricarboxylic acid，PTCA)含量测定和总抗氧化能力研究，以对此超声波辅助蛋白酶水解制备墨黑色素方法进行评价。对乌贼墨黑色素的制备工艺进行研究，不仅能为海洋生物活性物质开发开拓新来源，更能促进我国渔业水产品加工高值化利用的发展，具有重大的经济价值和社会意义。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

曼氏无针乌贼墨囊，宁德市南海水产有限公司；木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶(食品级)，南宁庞博生物科技有限公司；甲酸、甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器和设备

雷磁pHs-3c型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；

SCIENTZ-30ND型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；

KQ-700DE型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；

LG-21M冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；

E3100高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 墨粉的制备

乌贼墨囊室温解冻后，去除墨囊表皮膜，置于托盘中，逐级真空冷冻干燥72 h，制得干燥墨粉，密封保存备用。干燥的墨粉能保证试验原料的稳定性和均一性，有利于后续试验的开展。

1.3.2 蛋白酶的筛选

分别选用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶在相同蛋白酶量、水解时间1 h以及相应合适的pH、温度下超声波辅助水解墨粉。水解后加热至90℃保持5 min，使酶失去活性，8 000 r/min离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.3 水解度测定

采用甲醛电位滴定法测定水解后游离氨基酸总氮量，采用自动凯氏定氮法测定墨粉中总氮量，计算蛋白酶对乌贼墨粉的水解度。

水解度/%=水解后游离氨基酸总氮量/原料总氮量×100%

水解度越大，表示蛋白酶对墨粉中蛋白质水解程度越高，即更有利于墨黑色素的纯化制备。

1.3.4 酶解条件单因素试验和正交试验

选择最适的蛋白酶，以水解度为考察指标，进行酶解反应pH值、温度、时间、加酶量、固液比的单因素试验，并在此基础上进行五因素四水平L16正交试验，确定墨粉水解的最佳酶解条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 水解后墨黑色素氧化产物PTCA含量测定

在碱性过氧化氢条件下，墨黑色素中的DHICA被氧化为PTCA，通过HPLC法测定处理后墨黑色素中氧化产物PTCA含量。

标准品为Toronto Research Chemicals公司生产的PTCA。精密称取PTCA标准品，用0.1%甲酸配制母液，并稀释为梯度浓度溶液，以分析物峰面积(A)对分析物浓度(C)作线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程A=168.38C-78.96，R2=0.999 9。

供试样品的氧化处理：称取墨黑色素样品10 mg，添加950 μL 1 mol/L K2CO3和50 μL 30%H2O2，加热到90℃ 90 min，流水冷却后，加入100 μL 10%Na2SO3终止反应，加入6 mol/L HCl调pH值至2.6左右。在12 000 r/min离心10 min，过0.45 μm滤膜，注入HPLC分析测定。

色谱条件为色谱柱：E2720002(250 nm×4.6 nm，5 μm)；流动相：1%甲酸(A)-甲醇(B)；检测波长：270 nm，进样量：20 μL，流速：0.5 mL/min[12]。

1.3.6 水解后墨黑色素总抗氧化能力测定

总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒用于测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。作用原理：在酸性环境下，物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其总抗氧化能力。

总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，具体试验方法依照试剂盒说明书进行操作。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

在相同蛋白酶量、水解时间及相应合适的pH、温度下水解墨粉，比较不同蛋白酶对墨黑色素水解度大小，结果见表2。

表2 不同蛋白酶水解墨粉水解度的比较

通过蛋白酶的水解作用，将墨粉中与墨黑色素结合的蛋白质水解为可溶解的游离氨基酸，可获得更高纯度的墨黑色素。试验结果表明，在pH 3.0、温度45℃条件下超声波辅助酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高(6.44%)。与其他蛋白酶比较，在相同的酶解反应时间下，酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高，故选用酸性蛋白酶进行水解条件优化。

2.2 酶解条件单因素试验

依据酸性蛋白酶的特性和工艺条件，设计单因素试验，分别考察酶解反应pH值、温度、时间、加酶量、固液比对蛋白酶水解墨粉的影响，试验结果如图1。

图1a表明，反应pH在2.0～3.5时墨粉水解度较高；反应pH大于3.5时，墨粉水解度显著下降，这与酸性蛋白酶活性下降有关。图1b结果显示，温度过高或过低均不利于墨粉水解，在45℃时测得墨粉水解度最高。由图1c可知，在反应进行0～2 h内，水解度随反应时间延长而增大，而在2 h后水解度随反应时间延长而降低，这是因为酶促反应需要足够的反应时间，而当达到足够的酶解反应时间后，溶液达到饱和，所以水解度不再增加。图1d结果显示，当酸性蛋白酶添加量低于2%时，墨粉水解度随加酶量的增加快速增大，当加酶量大于2%时，水解度出现少量下降，这是因为反应pH值、温度、时间、固液比均固定时，加大酶量即增加蛋白质被酶切的概率，但当加酶量达到一定量后，而反应底物并未增加，所以水解度不会再因增加蛋白酶的量而继续增大。图1e表明，固液比过高或过低均不利于墨粉水解，当固液比为1∶15时测得水解度最高，这是由于墨粉比例过大，使得墨粉分布不均匀，降低酶解效率，而溶液比例过大，会影响超声波效率，使得水解度降低。单因素试验结果分析表明酸性蛋白酶水解墨粉最适反应pH为3.0，最适反应温度为45℃，最佳反应时间为2 h，最佳加酶量2%，最佳固液比1∶15。

2.3 酶解条件正交试验

在酸性蛋白酶水解墨粉的单因素试验基础上，进行五因素四水平L16(45)正交试验，优化墨粉水解的酶解条件，试验结果见表3。

表3 酸性蛋白酶水解墨粉L16(45)正交试验设计及结果

表3极差R值反映出对墨粉水解度影响最大的条件是反应pH，水解最佳条件为A4B3C3D4E2，即酶解温度50℃、水解时间2 h、加酶量3.0%，反应pH 3.5，料液比1∶15。在此最优条件下对墨粉进行重复验证水解试验，测得水解度为11.45%，高于正交试验结果的最高值9.77%，说明经过正交试验优化得到的水解条件是合理的。并以此最佳酶解条件对墨粉进行水解，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，进行冷冻干燥，制得水解后墨黑色素。

2.4 水解后墨黑色素氧化产物PTCA含量测定

按照1.3.4中色谱条件测定供试品溶液和PTCA对照品溶液，分离情况如图2和图3所示。分析计算其峰面积，换算PTCA含量为17.621 μg/mg。高翔等[13]通过高速离心法制备得到鱿鱼墨黑色素，测定其墨黑色素氧化产物PTCA含量为9.479 μg/mg。虽然本文采用超声波辅助酶解法有效水解了墨黑色素蛋白质，使墨黑色素氧化产物PTCA含量得到提高，但不同头足类动物墨汁中墨黑色素含量的比较还未有文献资料报道，不能确定不同原料对PTCA含量的影响，还需进一步试验分析。

2.5 水解前后墨黑色素总抗氧化能力的测定

以Fe2+终浓度A吸光值为纵坐标，绘制标准曲线线性回归方程为y=16.633x-0.001 7(R2=0.999 7)。通过将样品测定吸光值带入方程求得x(μmol/mL)。

活力单位定义：样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值所需的标准液离子Fe2+浓度表示。

水解前后总抗氧化能力测定见表4，乌贼墨粉经过超声波辅助蛋白酶水解，冷冻干燥制得水解后墨黑色素的抗氧化能力为18.9 U/g，此方法保持了样品99%的抗氧化能力。故超声波辅助蛋白酶可有效水解墨粉，同时能保留其抗氧化能力。

3 结论

在超声波辅助酶水解乌贼墨粉的试验中，酸性蛋白酶具有强于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的水解能力。通过单因素和正交试验优化得到酸性蛋白酶酶解乌贼墨粉的最佳条件为水解温度50℃、时间2 h、加酶量3.0%，反应pH 3.5，料液比1∶15，在此最优条件下对墨粉进行水解试验，测得水解度为11.45%。HPLC测定水解后墨黑色素氧化产物PTCA含量为17.621 μg/mg，水解后墨黑色素总抗氧化能力(T-AOC)为18.9 U/g，总抗氧化能力保持率为99%。