福建与山东、辽宁养殖仿刺参肠道菌群结构的差异分析

陆 振

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

仿刺参为北方自然分布种，随着“北参南养”的规模不断扩大，福建省仿刺参养殖规模跃居全国第三，2017年福建省仿刺参养殖产量达到27 935 t，全国总产量为219 907 t[1-2]。我国国土幅员辽阔，以秦岭-淮河为界划分为南、北方，南、北方在气候、水文、习俗等诸多方面都存在较大的差异。肠道菌群是肠道的重要组成部分，受自然环境差异、养殖模式差异、饵料差异等因素的影响，南移后的仿刺参肠道菌群结构是否还保持与北方养殖品种一致，亦或者有自己独特的菌群结构还有待进一步研究[3-8]。

为确定南移仿刺参肠道菌群结构的特异性，文章对我国主要仿刺参养殖产区(福建、山东、辽宁)所养殖的仿刺参肠道菌群结构进行对比分析。从山东烟台、辽宁大连等地购进与本地(莆田、霞浦)同等规格的仿刺参，采用Miseq高通量测序技术对几个产区的仿刺参样本的肠道菌群结构进行分析，旨在为今后进一步研究仿刺参肠道菌群与其摄食、消化、免疫等之间的关系提供了新的资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用仿刺参取自大连池塘养殖场、烟台池塘养殖场、福建霞浦海上吊笼养殖渔排、福建莆田池塘养殖场，选择体色正常、体质健壮、体表无损伤，个头大小均匀，养殖周期相同的个体用于实验研究。

1.2 试剂、材料和仪器

细菌DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)，超微量分光光度计(Nano drop 2000，美国Thermo Scientific公司)，Miseq高通量测序和生物信息学分析(委托上海美吉生物医药科技有限公司完成)。

1.3 样品采集方法

在无菌环境下，实验用仿刺参体表用75%酒精冲洗2～3遍，用灭过菌的剪刀剪开仿刺参体腔，取出肠道，用0.9%的无菌生理盐水冲洗肠道外壁，测量肠道的长度。将采集的仿刺参的肠道分别置于无菌试管(去皮)中称质量，分别编号为大连池塘养殖仿刺参(DL)、烟台池塘养殖仿刺参(YT)、霞浦海上吊笼养殖仿刺参(XP)、莆田池塘养殖仿刺参(PT)。随后分别置于无菌的研钵内充分研磨，加入5 mL无菌生理盐水冲洗研钵，得到仿刺参肠道匀浆[9]。用细菌DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司出品)完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。将DNA保存在-80℃。

1.4 Miseq高通量测序流程

正向引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；

反向引物806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

先PCR扩增，检测方法采用琼脂糖凝胶电泳进行，切胶回收产物按照Illumina公司标准流程测序。

1.5 生物信息学分析

舍弃低质量序列，对原始数据进行质量控制，得到的序列用于最终分析。将相似度大于0.97的测序序列归为1个操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)，分析记录各个样品所含OTU的数量，绘制稀疏曲线[10]。物种丰度的分析包括覆盖率(Coverage)、丰富度(Chao/Ace)以及多样性(Simpson/Shannon)[11-12]。同时在门和属两个分类水平上统计每个样品的物种丰度和物种分布，并做群落结构分析。

2 结果

2.1 仿刺参肠道细菌群落多样性指数分析

在丰富度(Chao/Ace)和多样性(Simpson/Shannon)上池塘养殖的仿刺参的肠道菌群比海上吊笼养殖高2倍多(表1)。其中烟台的仿刺参的丰富度最高，Simpson/Shannon指数达到4.78。丰富度指数Chao/Ace比测得的分类操作单元OTU高，说明肠道内还有部分细菌没有检测到。

2.2 仿刺参肠道群落结构分析

在门的水平上(图1)，仿刺参的肠道菌群发现20个细菌门，群落结构主要由7个细菌门组成，分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidete)、蓝藻门(Cyanobacteri)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)等，其中大连、烟台的仿刺参肠道菌群以变形菌门、拟杆菌门为主(>85%)。莆田池塘养殖仿刺参和霞浦仿刺参肠道菌群以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为主(>85%)。大连、烟台、莆田、霞浦的仿刺参肠道的主要优势菌群分别为变形菌门(60.9%)、变形菌门(87.48%)、厚壁菌门(40.98%)、厚壁菌门(63.01%)(表1)。

表1 不同地区仿刺参肠道样品多样性指数

注：DL—大连池塘养殖仿刺参；YT—烟台池塘养殖仿刺参；XP—霞浦海上吊笼养殖仿刺参；PT—莆田池塘养殖仿刺参。下同。

Notes：DL—sea cucumber cultured in Dalian ；YT—sea cucumber cultured in Yantai ；XP—sea cucumber cultured in Xiapu；PT—sea cucumber cultured in Putian.The same as below.

表2 不同地区仿刺参肠道样品在门水平上的丰度

Taxonomy/% AbundanceDLYTPTXP Proteobacteria 60.9087.4831.819.05 Firmicutes 1.680.6740.9863.01 Bacteroidetes 25.246.9210.4224.45 Actinobacteria 1.271.737.292.04 Verrucomicrobia 6.080.330.680.11 Cyanobacteria 2.810.093.370.48 Chloroflexi 0.340.563.360.63 Others2.442.333.670.08

在属的水平上(图2)，四个产地仿刺参肠道中共检测到317个细菌种属。大连养殖仿刺参肠道的主要优势菌群为Lutibacter(10.13%)，属拟杆菌门的黄杆菌科，是一种兼性厌氧菌。烟台养殖仿刺参肠道的主要优势菌群为Haliea(21.34%)和Halioglobus(12.58%)。福建两种养殖仿刺参肠道群落结构主要由乳球菌属(Lactococcus)、Formosa、芽孢杆菌属(Bacillus)、Solibacillus、假单胞菌属(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、链球菌属(Streptococcus)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、杆菌属 (Lysinibacillus)、Marinosulfonomonas、Pseudoruegeria等几十个属组成。其中乳球菌属、芽孢杆菌属所占比例较高。在霞浦养殖仿刺参肠道中Formosa含量最高，占细菌总数的比例为87.06%，其次为乳球菌属(Lactococcus)，占细菌总数比例为7.71%(表3)。

表3 不同地区仿刺参肠道样品在属水平上的丰度

Taxonmy/% AbundanceDLYTPTXP Lactococcus0.310.1324.5047.70Lutibacter10.131.140.900.11Tateyamaria6.920.850.000.00Formosa0.000.000.0025.09Lutimonas6.592.950.000.00Rhodobacteraceae6.511.622.751.20Haliea6.4821.343.740.01Halieaceae5.082.560.000.00Halioglobus3.9312.580.280.00 Psychromonas3.000.451.273.08Shewanella2.690.240.000.00 Cyanobacteria1.950.062.610.48Lentimonas1.950.020.000.00Roseobacter1.840.682.260.04Desulfobulbaceae1.593.800.050.00 Vibrio1.490.080.000.12Flavobacteriaceae1.420.802.740.02Winogradskyella0.410.041.380.00Prevotella0.240.001.560.00Caldilineaceae0.220.212.200.24 Streptococcus0.070.061.991.47 Bacillus0.030.025.559.36 Arthrobacter0.020.021.841.98 Ruegeria0.000.001.560.12Solibacillus0.000.001.623.22 Others37.0150.3241.235.71

3 结论

通过高通量16S rRNA序列分析发现，大连池塘养殖仿刺参的肠道菌群以变形菌门为主，在整个仿刺参肠道中占60.90%，其次为拟杆菌门，占比为25.24%。烟台池塘养殖仿刺参的肠道菌群以变形菌门为主要优势菌群，在整个仿刺参肠道中占87.48%。福建吊笼养殖仿刺参的肠道菌群以厚壁菌门为主，在整个仿刺参肠道中占59.04%，主要为乳球菌属和芽孢杆菌属，其次分别为拟杆菌门和变形菌门，分别占29.86%和8.14%。福建池塘养殖仿刺参的肠道菌群总体以厚壁菌门为主(主要为芽孢杆菌属和乳球菌属)，其次为拟杆菌门和变形菌门，其中乳球菌属、芽孢杆菌属和链球菌属等厚壁菌门菌株，拟杆菌门中的黄杆菌属和Winogradskyella属占比较高。两种养殖模式仿刺参的肠道菌群都以厚壁菌门为主，主要为乳球菌属和芽孢杆菌属，其次为变形菌门。

池塘养殖的仿刺参的肠道菌群的丰富度指数以及多样性指数高于海上吊笼养殖，但在相似性上差异性较大。有研究表明厚壁菌门至少含有44 种与抗性淀粉降解酶有关的基因[13]，所以厚壁菌门可以降解宿主所不能降解的多糖，为宿主提供能量，而拟杆菌门也能降解一大类不能被消化的植物多糖。乳球菌属和芽孢杆菌属均为厚壁菌门的细菌，为革兰氏阳性菌，在维持动物肠道健康中起重要作用。Formosa属于拟杆菌门，是Ivanova等[14-16]在2004年提出的为革兰氏阴性菌、异养型，其耐盐，能够分解糖。因此，4个实验组的菌群结构和所占比例存在较大的差异，这种差异与仿刺参的生产地、食物来源不同有关。

造成南北方养殖仿刺参肠道菌群结构有这么大的不同的原因，可能是地理位置和养殖方式的不同。地理位置不同导致仿刺参生长的海区环境不一样，这是导致南北方仿刺参肠道菌群差异最重要的原因。大连、烟台和莆田的仿刺参都是池塘养殖，但是它们的养殖方式不同。大连养殖的密度为40 kg/667 m2，换水量较小；烟台的养殖密度为100 kg/667 m2，密度高换水量大，投药量大；虽然莆田和霞浦养殖的仿刺参都在福建的海区养殖，但是菌群结构依然有较大的差别。霞浦的养殖方式为海上筏式吊笼养殖，需要每天喂养，而仿刺参食物来源单一，从而导致仿刺参肠道菌群结构丰富度不高。池塘养殖仿刺参的肠道菌群的丰富度较高，可以较好地抵抗来自病原菌的侵害。

在海洋环境和生物体内，弧菌是最常见的一类条件致病菌，宿主的生理状态和水质环境等因素对其致病性的影响较大。近年来有关弧菌的研究，是海水养殖动物病害的主要研究热点[17]。在用传统的分离培养方法对海洋菌分离鉴定时，弧菌占有一定的比例[18]。但在本研究中弧菌属在仿刺参的肠道内所占比例较小，为0.2%。从而可知弧菌属在健康仿刺参的肠道中的量是很少的。高菲等[19]利用PCR变性梯度凝胶技术(PCR-DGGE)研究了仿刺参不同部位肠道内含物的细菌群落组成，发现仿刺参不同部位肠道的内含物的优势菌群相同，均为γ-变形菌纲；发现其中大多数细菌的16S rDNA序列与目前不能培养的海洋沉积物环境中获得的细菌序列相似，表明仿刺参肠道的细菌群落结构受栖息地环境影响较大。有资料指出，仿刺参的肠道主要是吸收和代谢营养物质的场所[20-21]，因此，肠道中的细菌群落可能在仿刺参的消化分解过程中起作用，其具体的功能仍需要进一步的研究。另外，研究手段和地域环境不同也可能是造成仿刺参肠道细菌群落结构不同的重要原因。

细菌的16S rDNA常被用于传统方法难以培养的细菌鉴定分析。本研究用细菌16S rDNA V3-V4 可变区序列分析技术与高通量测序技术相结合，分析福建(莆田和霞浦)、大连和烟台地区养殖的仿刺参肠道微生物的细菌群落组成。研究结果表明，Miseq高通量测序技术克服了细菌常规分离培养的限制，能快速、准确地分析肠道中的细菌群落结构。肠道正常菌群是肠道的组成部分，肠道菌群的不同体现了肠道功能的差异性。外部环境会影响仿刺参的肠道菌群组成，从而影响肠道的吸收、消化等功能。本研究首次利用高通量测序技术对养殖仿刺参肠道中的菌群进行测序分析，且研究中检测到的细菌多数是传统方法未检测到的，这些细菌可能在仿刺参养殖和疾病防控方面具有重要应用价值。这为今后进一步研究仿刺参肠道菌群与其摄食、消化、免疫等之间的关系提供了新的资料。研究中发现4个地方仿刺参肠道内的菌群结构都有一定的差异，所以现在市场上的适用于大连、山东的益生菌制剂并不一定适用于福建地区养殖的仿刺参，为了进一步研究益生菌的效用，建议从南方养殖仿刺参的肠道内选取原籍益生菌，这样对福建养殖仿刺参会更有针对性。