常规水解法和氧化水解法对饲料及饲料原料中含硫氨基酸测定结果的比较分析

贺习文，李 宏，高勤叶，汪军明，王 佳，郭 爽

（1.陕西秦云农产品检验检测有限公司，陕西 渭南 714000；2.农业农村部饲料质量监督测试中心，西安 710016）

氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨基酸在动物体内通过代谢，可以合成动物组织的蛋白质，以及合成体内必须的酸、抗体、激素等含氨物质，除此之外，氨基酸还能转变为碳水化合物和脂肪，为动物提供必须的能量，所以氨基酸对动物的生长、繁殖和哺乳有着至关重要的作用[1]。

目前已知的氨基酸种类有200多种，饲料中比较常见的有天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等17种常规氨基酸，在这17种常规氨基酸中，蛋氨酸和胱氨酸属于含硫氨基酸，含硫氨基酸对生长发育阶段的畜禽有着显著的影响，在日粮中添加适量的含硫氨基酸可以显著提高生产性能，因此对饲料中含硫氨基酸含量的监控显得尤为重要[2-5]。含硫氨基酸的测定方法中，有GB/T 18246-2000“饲料中氨基酸的测定”中的常规水解法和GB/T 15399-1994“饲料中含硫氨基酸测定方法——离子交换色谱法”中的氧化水解法[6-7]。于淑新等利用高效液相色谱-柱前衍生化法测定饲料中的含硫氨基酸，农晋琦等利用气相色谱法测定结合态含硫氨基酸[8-9]。

常用测定饲料及饲料原料中的含硫氨基酸的方法为常规水解法和氧化水解法，但在实验中发现这两种方法往往会出现两种不同的结果[10-12]。本试验利用GB/T 15399中氧化水解法和GB/T 18246-2000中的常规水解法两种方法来对饲料及饲料原料中的含硫氨基酸进行测定，旨在探讨哪一种前处理方法对含硫氨基酸的测定结果最佳，为饲料和饲料原料中含硫氨基酸的测定方法的选择提供参考。

1 试验原理、材料及方法

1.1 试验原理

1.1.1 常规水解法原理

常规水解法是使饲料蛋白在110℃、c（HCl）=6 mol·L-1盐酸作用下，水解成单一氨基酸，再经离子交换色谱法分离并以茚三酮做柱后衍生测定。

1.1.2 氧化水解法原理

饲料中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化并经盐酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，此二物可用离子交换色谱法分离测定。

1.2 试验材料

1.2.1 试剂及溶液

盐酸（优级纯）；柠檬酸三钠（分析纯）；硫二甘醇（分析纯）；苯酚（分析纯）；过氧化氢（30%优级纯）；甲酸（88%分析纯）；硝酸银（分析纯）；偏重亚硫酸钠（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；一级水。

6 mol·L-1盐酸溶液：量取500 mL盐酸混入提前准备好的500 mL水中。

6.8 mol·L-1盐酸溶液：量取567 mL盐酸混入提前准备好的433 mL水中。

过甲酸溶液：将30%过氧化氢和88%甲酸按1∶9的体积比混合，在室温中放置1 h，冰水浴中放置30 min，临用前配制（浓缩料需按3 mg·mL-1加入硝酸银）。

偏重亚硫酸钠溶液：称取33.6 g偏重亚硫酸钠加水定容至100 mL，临用前配制。

柠檬酸钠缓冲液（pH=2.2）：称取柠檬酸三钠19.6 g，用水溶解后加入盐酸16.5 mL，硫二甘醇5.0 mL，苯酚1 g，加水定容至1 000 mL。

100 nmol·L-1混合氨基酸标准工作液：含有磺基丙氨酸、蛋氨酸砜、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸等20种氨基酸标准工作液。

1.2.2 仪器及设备

德国曼默博尔A300氨基酸分析仪（570 nm和440 nm双波长）；恒温干燥箱；十万分之一天平；万分之一天平；旋转蒸发仪；涡轮混合器。

1.3 试验方法

1.3.1 试验用样品

鸡用配合饲料、猪用浓缩饲料、鱼粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣共6种不同基质样品，通过旋风磨粉碎，全部通过60目的样品筛，混合均匀，保存在4℃的冰箱中冷藏。

1.3.2 前处理方法

样品按照GB/T 18246-2000中常规水解法，称取100 mg样品于水解管中，加入6 mol·L-1盐酸溶液10.0 mL，置液氮中冷冻后抽真空封口，放在恒温干燥箱中110℃下水解24 h，冷却，摇匀，过滤，吸取约0.3～0.5 mL试样液于旋转蒸发仪上蒸发至干，加少许水重复蒸发至干，再加入3～5 mL柠檬酸钠缓冲液（pH=2.2）溶解，涡轮混合，过0.22µm水相膜后上机测定。

样品按照GB/T 15399-1994中氧化水解法，称取50 mg样品于水解管中，加入冷却后的过甲酸溶液2 mL，放置在0℃冰水浴中反应16 h，取出后加入偏重亚硫酸钠溶液0.5 mL，剧烈摇匀以终止反应，再加入6.8 mol·L-1盐酸溶液17.5 mL，封口，放在恒温干燥箱中110℃下水解24 h，冷却，摇匀，过滤，吸取试样液约0.3～0.5 mL于旋转蒸发仪上蒸发至干，加少许水重复蒸发至干，再加入柠檬酸钠缓冲液（pH=2.2）1～2 mL，溶解，涡轮混合，过0.22µm水相膜后上机测定。

2 试验结果

2.1 色谱图比较

按照2.3中的试验方法，分别取配合饲料、浓缩饲料、鱼粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣等不同的样品，按照GB/T 18246常规水解法和GB/T 15399氧化水解法分别对含硫氨基酸进行定性、定量分析。为鸡用配合饲料用两种方法所做试验的图谱见图1～2。

图1 鸡用配合饲料常规水解法图谱

图2 鸡用配合饲料氧化水解法图谱

由图1和2可知，胱氨酸和蛋氨酸经过过甲酸溶液氧化后，再经过110℃的盐酸溶液水解，已经完全转换为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，通过对磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的计算，从而得到胱氨酸和蛋氨酸的实际含量。通过对不同样品进行实验，得到的实验数据如表1所示。

使用常规水解法和氧化水解法分别测定饲料及饲料原料中含硫氨基酸时，氧化水解法检测的胱氨酸和蛋氨酸的值明显比常规水解法高，只有鱼粉及肉粉等动物性原料的蛋氨酸差距很小，两种方法的偏差都在允许误差之内。

2.2 精密度和稳定性比较

表1中的鱼粉1样品为能力比对样品，将鱼粉1样品用常规水解法和氧化水解法分别处理8组平行样品，得到的蛋氨酸结果和相对标准偏差RSD如表2。

由表2可知，同时处理8组平行样品，氧化水解法的RSD为1.7%，常规水解法的RSD为2.0%，氧化水解法明显优于常规水解法。

2.3 回收率比较

鱼粉1样品为有准确检测数值的质控样品，其胱氨酸的实值为0.57，误差为±0.06，蛋氨酸的实值为1.72，误差为±0.24，用氧化水解法和常规水解法分别对鱼粉1样品中的胱氨酸和蛋氨酸进行检测，得出的结果和回收率见表3。

由表3可知，两种方法同时检测鱼粉中的含硫氨基酸，结果表明常规水解法检测胱氨酸的回收率为61.4%，蛋氨酸的回收率为103.5%；氧化水解法检测胱氨酸的回收率为96.4%，蛋氨酸的回收率为102.9%，氧化水解法明显优于常规水解法。

表1 不同样品常规水解法和氧化水解法的实验数据 %

表2 两种方法得到的蛋氨酸结果和相对标准偏差RSD

表3 两种方法检测含硫氨基酸的实测值和回收率 %

3 结果与讨论

试验结果表明，使用常规水解法和氧化水解法分别测定饲料及饲料原料中含硫氨基酸，氧化水解法检测6种不同基质样品的胱氨酸和蛋氨酸值明显高于常规水解法，其中鱼粉及肉粉等动物性原料的蛋氨酸差距不大，两种方法检测的值都在允许误差之内。另外以质控样品作为参考，分别使用两种方法测定其含硫氨基酸，结果表明，氧化水解法检测的结果比常规水解法要更加准确，回收率更高，且稳定性更好，更适用于饲料及饲料原料中含硫氨基酸的检测。目前有很多测定饲料中含硫氨基酸含量的新方法，但对测定仪器和操作人员的要求较高[13-16]。因此，建议浓缩饲料、配合饲料、豆粕等植物性饲料采用氧化水解法测定含硫氨基酸，肉粉、鱼粉、羽毛粉等动物性饲料及原料采用氧化水解法测定胱氨酸，采用常规水解法测定蛋氨酸。这样能够为实验者提供方法选择参考，同时因为常规水解法操作简单，能够节省时间和试剂材料，有良好的使用价值。