微小RNA- 365和靶向E74样受体4在宫颈癌细胞的增殖及其临床意义

郭 颖，马 冬，贾世峰，刘 佳，樊少蓓，张 梦，石琳然，蒋利丽，史珏鑫，王海秋，郑寰宇，李 鸥

1华北理工大学研究生学院，河北唐山 0632002华北理工大学附属医院肿瘤外科，河北唐山 0630003唐山市工人医院妇二科，河北唐山 063000

近年虽然宫颈癌发病率的趋势略有下降，但死亡率仍持续稳定[1]。由于宫颈癌的发病机制仍不明确，导致宫颈癌的晚期治疗及预后效果仍然不佳[2- 3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码小RNA，是肿瘤发生中重要的生物标记物[4]，通过靶向抑制参与肿瘤发生的相关基因表达从而发挥生物学功能，其中包括抑制转录因子的表达。尽管已有报道miRNA芯片筛选证实miR- 365在宫颈癌组织中表达下调[5]，但是其相关研究及分子机制仍未见报道。E74样因子4(E74-like factor 4，ELF4)是转录因子ETS家族的一个成员，已被证明参与免疫反应、成骨、成脂、癌症发生的过程[6]。有报道在卵巢恶性上皮性肿瘤中，ELF4异常表达升高明显促进肿瘤细胞的增长[7]。另外，通过生物信息学预测发现miR- 365与ELF4的3’非翻译区(3’UTR)存在潜在的互补结合位点，而宫颈癌也是起源于宫颈上皮的恶性肿瘤，推测ELF4可能作为miR- 365的靶基因发挥肿瘤增殖功能的调控作用。因此，本研究探讨miR- 365在宫颈癌中的表达及其与ELF4的关系和临床意义，为宫颈癌的诊治提供新的分子靶点。

对象和方法

对象选取2014年7月至2017年1月在唐山工人医院行宫颈活检及手术治疗的病例，临床资料完整，且术前并未接受过放化疗的病例，共135例，其中行全子宫切除的良性病变正常宫颈34例，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)68例(其中CINⅠ31例、CINⅡ～Ⅲ 37例)，术后病理回报为宫颈鳞癌(squamous cell carcinoma of the cervix，SCC)33例。CIN组及SCC组纳入标准：(1)临床资料完整；(2)病理明确诊断为 CIN、SCC；(3)术前未接受过放、化疗。排除标准：(1)术前 3 个月内曾行宫颈治疗，如阴道用药、激光治疗等；(2)患者为妊娠状态；(3)同时合并其他妇科恶性肿瘤，如子宫内膜癌、卵巢癌等；(4)同时合并其他脏器肿瘤，如肠道、乳腺肿瘤等。正常组纳入标准：宫颈薄层液基细胞学检查未见非典型鳞状细胞或癌细胞。排除标准与CIN组及SCC组相同。所取标本均经本院病理科主任医师证实，且取材前均未行放疗、化疗或免疫治疗。标本收集后于-80 ℃冰箱保存。所有标本取材患者知情同意，本研究经唐山工人医院伦理委员会批准。临床分期按国际妇产科联盟(2009年)标准分期，病理类型及分型按WHO标准(2003版)[8]。

实时荧光定量PCR检测miR- 365在宫颈癌细胞中的表达将液氮保存的宫颈组织或培养的宫颈癌细胞采用Trizol试剂提取总RNA(依据RNA提取试剂盒说明)，包括miRNA，对miRNA进行分析，miR- 365的茎环RT引物参考序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATAAGG- 3’，实时荧光定量PCR引物序列为：5’-CGTAATGCCCCTAAAAAT- 3’和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT- 3’。采用U6作为内参，实时荧光定量PCR引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3’[9]。扩增反应条件：95 ℃预变性180 s、95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，变性、退火循环39次。用公式2-△△Ct循环阈值法将miR- 365的相对表达水平归一化为内参U6的相对表达水平，每组实验重复3次[10]。

生物信息学预测miR- 365对ELF4的调控使用TargetScan 数据库(www.targetscan.org)预测miR- 365对人ELF4基因3’非翻译区(3’UTR)靶向调控关系。

双荧光素酶报告基因分析miR- 365对ELF4的靶向调节作用设计PCR扩增引物5’-CGGAAGTGCTTTC-AGACTCC- 3’和5’-GGTCAGTGACAGGTGAGGTA- 3’，构建含有miR- 365应答序列的人ELF4的3’UTR 片段，并插入到荧光素酶报告基因质粒中形成ELF4-Luc质粒。1×105Hela细胞接种于24孔板上，待细胞密度为80%后进行转染。miR- 365 模拟物组(实验组)和正常对照模拟物组(对照组)的终浓度为50 nmol/L，每孔分别加入0.5 μg ELF4-Luc质粒及10 ng pRL-SV40 报告基因载体。转染试剂采用Lipofectamine 2000。转染6 h后换成10% FBS的高糖DMEM，再继续培养24 h。预冷的PBS冲洗两次，每个孔分别加入100 μl的1×细胞裂解液，室温下震荡裂解10 min。分别吸取每个孔的细胞裂解液到无菌的1.5 ml EP管中，4 ℃12 000×g离心2 min。每个孔取20 μl上清液于Dual-GloTM Luciferase分析系统进行荧光检测。荧光素酶分析试剂购自美国Promega公司。

Western blot蛋白检测兔抗ELF4多克隆抗体(Sigma-Abnova公司，货号：H00002000-A01)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG、羊抗鼠IgG二抗，增强型化学发光底物试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)。细胞裂解法提取细胞总蛋白，采用BCA法检测总蛋白含量，10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维膜转印，5%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶1000稀释)4 ℃过夜孵育、洗膜、二抗(1∶2000稀释)避光室温孵育，洗膜，显色。β-actin为内参蛋白。通过Image J图像分析软件分析条带灰度值，以目标蛋白条带灰度值/内参条带灰度值表示目的基因相对蛋白表达水平，每组实验重复3次。

免疫组织化学检测宫颈组织中ELF4蛋白表达所有标本均经10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片厚约4 μm。免疫组织化学均采用SP法按说明书进行。随机选取5个癌巢内的视野，通过IPP 6.0图像分析软件分析棕色颗粒在整个视野内所占的百分比。

体外细胞培养HeLa、C33A、SiHa细胞株及正常宫颈上皮细胞株(HcerEpic)均由河北医科大学附属第四医院肿瘤研究所馈赠，以含10%胎牛血清RPMI 1640培养基、5%二氧化碳、37 ℃恒温培养箱中常规培养，细胞密度4×104/ml，取对数生长期细胞用于实验。

CCK8法检测3种宫颈癌细胞株增殖情况(1)取生长状态良好的对数生长期的细胞，分为miR- 365模拟物组、正常对照模拟物组、miR- 365抑制剂组、正常对照抑制剂组和空白对照组，每孔按 4×103个接种至 96 孔板中，每组设置8个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后转染相应质粒；(2)培养细胞0、24、48、72和96 h后，每孔加10 μl CCK8，置于培养箱中继续培养2 h；(3)用酶标仪测波长为450 nm的光密度值(optical density，OD)值。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。按公式计算生长抑制率=[(实验组OD-对照组OD)/对照组OD]×100%，以时间为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制折线图。

统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料均经正态性及方差齐性检验，以均数±标准差表示，两组间计量资料比较采用t检验，组间两两比较采用q检验，采用Spearman秩相关性分析；计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

miR- 365在人宫颈癌组织中的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，与正常宫颈组织比较，在人宫颈癌组织中miR- 365的表达水平降低(0.75 比 1.31，t=3.802，P=0.001)(图1A)；同样在体外培养细胞中，与正常宫颈上皮细胞HcerEpic比较，在3种宫颈癌细胞(C33A细胞、HeLa细胞、SiHa细胞)中miR- 365的表达均明显下调，差异有统计学意义(SiHat=28.579，SiHaP=0.001；C33At=8.351，C33AP=0.013；HeLat=6.435，HeLaP=0.026)(图1B)。

转录因子ELF4是miR- 365的直接靶点通过TargetScan 数据库在线预测分析显示，在ELF4的3’UTR上存在miR- 365结合的种子序列，提示miR- 365可能直接靶向调节ELF4基因的表达(图2A)；进一步荧光素酶报告基因实验证实，过表达野生型miR- 365，ELF4荧光素酶活性明显降低(t=2.896，P=0.028)，表明miR- 365显著靶向抑制ELF4基因的表达，而过表达突变型miR- 365，这种抑制作用消失(t=0.089，P=0.272)(图2B)。

ELF4在宫颈癌细胞中的表达Western blot检测结果显示，与正常宫颈上皮细胞比较，3种宫颈癌细胞中ELF4的蛋白表达水平均增高(t=8.821，P=0.013；t=22.327，P=0.002；t=6.985，P=0.004)(图3)。

不同病理宫颈组织中ELF4蛋白的表达ELF4作为核蛋白发挥转录功能时免疫组织化学染色可见细胞核呈棕黄色颗粒。ELF4在正常宫颈组、CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ～Ⅲ组及SCC组的阳性染色面积百分比分别为(10.03±3.05)%、(20.12±2.88)% 、(71.20±3.43)%、(81.23±9.02)%，与正常宫颈组相比，CINⅡ～Ⅲ组及SCC组表达明显增高(t=0.732，P=0.575；t=22.328，P=0.002；t=32.232，P=0.001)(图4)。

Normal：正常宫颈组织；SCC：宫颈鳞癌；at=3.802，aP=0.001；与HcerEpic细胞比较，bt=28.579，bP=0.001，ct=8.351，cP=0.013，dt=6.435，dP=0.026

Normal：normal cervical tissue；SCC：squamous cell carcinoma of the cervix；at=3.802，aP=0.001；bt=28.579，bP=0.001，ct=8.351，cP=0.013，dt=6.435，dP=0.026 compared with HcerEpic cell

A.实时荧光定量PCR方法检测正常宫颈组织、SCC组织中miR- 365的表达情况；B.实时荧光定量PCR方法检测3种宫颈癌细胞(C33A、HeLa、SiHa)中miR- 365的表达

A.expressions of miR- 365 in normal cervical tissue and SCC were detected by real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction；B.expressions of miR- 365 in three cervical cancer cells(C33A，HeLa，SiHa)and normal control cervical cell HcerEpic were detected by real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction

图1miR- 365在人宫颈癌组织中的表达

Fig1Expression of miR- 365 in human cervical cancer

ELF4：E74样受体4；WT：野生型；Mut：突变型；aP=0.028

ELF4：E74-like factor 4；WT：wild type；Mut：mutant；aP=0.028

A.TargetScan 数据库预测miR- 365与ELF4的结合位点；B.荧光素酶报告基因分析miR- 365对 ELF4的靶向抑制作用

A.prediction of the binding site of miR- 365 with ELF4 3’-UTR by TargetScan database；B.analysis of the targeted inhibition of ELF4 by miR- 365 by using luciferase reporter gene assay

图2miR- 365靶向调节ELF4的表达

Fig2Targeted regulation of ELF4 expression by miR- 365

与HcerEpic细胞比较，at=8.821，aP=0.013，bt=22.327，bP=0.002，ct=6.985，cP=0.004

at=8.821，aP=0.013，bt=22.327，bP=0.002，ct=6.985，cP=0.004 compared with HcerEpic cell

图3Western blot检测ELF4在3种宫颈癌细胞中的表达情况

Fig3Expression of ELF4 in three cervical cancer cell lines(Western blot)

CIN：宫颈上皮内瘤变；与Normal比较，at=22.328，aP=0.002，bt=32.232，bP=0.001

CIN：cervical intraepithelial neoplasia；at=22.328，aP=0.002，bt=32.232，bP=0.001 compared with Normal

图4免疫组织化学反应ELF4在不同组织中的表达

Fig4Expressions of ELF4 in different tissues(immunohistochemistry)

miR- 365过表达或低表达对宫颈癌细胞增殖的影响CCK8结果显示，在3种宫颈癌细胞中，与转染正常对照模拟物组比较，miR- 365 模拟物组的OD450值在48 、72和96 h均显著降低(SiHa：48 ht=5.212，48 hP=0.039；72 ht=6.958，72 hP=0.024；96 ht=7.045，96 hP=0.017；C33A：48 ht=0.986，48 hP=0.046；72 ht=6.378，72 hP=0.022；96 ht=7.545，96 hP=0.015；HeLa：48 ht=5.833，48 hP=0.035；72 ht=6.256，72 hP=0.028；96 ht=6.477，96 hP=0.022)；相反，与转染正常对照抑制剂组比较，miR- 365抑制剂组3种细胞株的OD450值在48、72和96 h均升高(SiHa：48 ht=0.988，48 hP=0.043；72 ht=1.163，72 hP=0.037；96 ht=1.886，96 hP=0.020；C33A：48 ht=0.973，48 hP=0.044；72 ht=1.412，72 hP=0.034；96 ht=7.215，96 hP=0.014；HeLa：48 ht=1.447，48 hP=0.032；72 ht=1.856，72 hP=0.021；96 ht=9.869，96 hP=0.011)(图5)。

ELF4的表达与肿瘤大小、肿瘤病理分级及临床分期的相关性在正常宫颈组织组、CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ～Ⅲ组及SCC组miR- 365与ELF4 mRNA表达进行相关性分析，将miR- 365及ELF4 mRNA在宫颈鳞癌中表达情况分为低表达组及高表达组，并与临床病理参数进行分析。结果显示在正常宫颈组织组和CINⅠ组，miR- 365与ELF4 mRNA表达无相关性(r=0.227，P=0.285；r=-0.073，P=0.752)，而在CINⅡ～Ⅲ组及SCC组，两者间表达呈负相关(r=-0.351，P=0.045；r=-0.349，P=0.035)(图6)，同时，进一步临床病理参数分析表明，miR- 365和ELF4 mRNA的表达水平均与肿瘤大小、肿瘤病理分级及临床分期相关(P均<0.05)(表1、2)。

讨 论

miRNA通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区特异性结合，进而调控多个靶基因的转录后表达并发挥肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学功能，已成为诊断和治疗癌症的新靶点[11]。有报道miR- 365在肝癌细胞中呈低表达，主要机制是通过靶向抑制人解整合素样金属蛋白酶10的表达调控肝癌细胞的增殖活性[12]；而其在恶性黑色素瘤中主要是通过靶向神经纤维网蛋白1抑制黑色瘤细胞的增殖[13]；在胃癌中主要通过靶向转录因子2抑制胃癌细胞的增殖[14]。通过前期miRNA表达谱芯片筛查和本研究实时荧光定量PCR验证，发现miR- 365在宫颈癌细胞和组织中的表达下调，并且其表达与肿瘤大小、病理分级及临床分期相关，提示其表达变化可能参与宫颈癌变过程，是肿瘤增殖的负向调节因子。

与正常对照模拟物组相比，aP<0.05；与正常对照抑制剂组相比，bP<0.05

aP<0.05 compared with normal control mimic group；bP<0.05 compared with normal control inhibitor group

A.SiHa；B.C33A；C.HeLa

图5miR- 365抑制物或类似物对3种宫颈癌细胞增殖的影响

Fig5Effects of miR- 365 inhibitors or analogues on the proliferation of three cervical cancer cell lines

A.CIN Ⅱ-Ⅲ；B.SCC

图6不同宫颈病理组织中miR- 365和ELF4的表达水平的相关性

Fig6Correlation between miR- 365 and ELF4 expressions in different cervical tissues

表1 宫颈鳞癌中miR- 365的表达与临床病理特征的关系Table 1 Correlation between miR- 365 expression and clinicopathological features of squamous cell carcinoma of the cervix tissues

表2 宫颈鳞癌中ELF4 mRNA的表达与临床病理特征的关系

人乳头瘤病毒感染作为宫颈癌发生的必要因素，可通过改变相关的转录因子调节miRNA的表达[15]。因此推测，miR- 365可能通过调节下游增殖调控相关基因，抑制宫颈癌细胞的增殖活性和肿瘤的发生。ELF4是参与多种生物学过程的转录因子，是ETS家族中的一员，从有丝分裂到细胞凋亡参与细胞活动的基因表达变化[16]，在上皮细胞中能够组成性的激活溶菌酶基因、上调人β防御素2基因的转录水平[17]，可作为癌基因，在人类癌症中过表达，通过逆转录病毒插入的方式诱导癌症的发生[18]。相关文献报道，ELF4在多种癌症中表达上调[5，19]，高表达患者预后较差。基于生物信息学分析预测，将ELF4作为miR- 365抑制肿瘤增殖的调控目标，本研究证明ELF4基因在宫颈癌组织和细胞中表达均上调，并且其表达水平随着宫颈组织病变的发展逐渐上调，荧光素酶报告基因实验证实ELF4是受miR- 365调控的有效靶点。最后，通过相关性分析证实在宫颈癌组织中miR- 365与ELF4的表达呈负相关。因此，miR- 365靶向调节ELF4的表达在宫颈癌的发生和发展过程中可能发挥了重要作用，抑制ELF4的表达可作为治疗宫颈癌的潜在分子靶点。

探讨癌细胞增殖的分子机制是至关重要的，人们普遍认为细胞周期失调是肿瘤增殖的重要因素[20]。本研究显示miR- 365在高级别宫颈病变及宫颈鳞癌中调节下游增殖功能相关基因的转录因子ELF4起到抑制肿瘤增殖的作用，但动物实验整体验证miR- 365及其下游靶分子与肿瘤生长的关系是本研究的一个限制，因此，进一步研究ELF4如何参与宫颈肿瘤发生、发展的分子机制及其生物学功能验证将是下一步研究重点。

综上，miR- 365在宫颈癌中表达下调，从而降低对ELF4表达的抑制作用，促进宫颈癌细胞的增殖。因此激活miR- 365或抑制ELF4的表达可能是治疗宫颈癌的有效措施。本研究为针对宫颈癌的进一步的临床研究和新的治疗靶点的研发奠定了基础。