核糖体蛋白S9在多发性骨髓瘤中的表达及对其细胞生物学功能的影响

宋鹍鹏，舒 鹏，马炬雷，王 兵，陈 博

宁波市北仑区人民医院 浙江大学附属第一医院北仑分院 1手足外科 2分子实验室，浙江宁波 315800

多发性骨髓瘤主要症状与特征包括骨痛、贫血、高钙血症、肾功能受损以及反复感染等[1]，多发性骨髓瘤的预后整体较差且复发率较高[2]，因此改善多发性骨髓瘤的治疗方式成为研究热点。目前多发性骨髓瘤的靶向药物包括蛋白酶体抑制剂[3]、免疫调节药物[4]，靶向治疗药物能够更好地提高患者总体生存率[5]。但与此同时，靶向药物的耐药层出不穷[6]，而开发新的靶点，从而克服耐药成为必需。核糖体蛋白S9(ribosomal protein S9，RPS9)是一种B23相互作用蛋白，其缺失被认为能够激活p53，从而诱导细胞凋亡、分化[7]，而RPS9与多发性骨髓瘤之间的关系报道较少。本研究主要明确RPS9在骨髓瘤中的表达及其对骨髓瘤细胞生物学功能的影响。

材料和方法

材料CD138磁珠分选试剂盒EasySepTMHuman CD138 Positive Selection Kit Ⅱ购自美国STEMCELL 公司(货号：17877)，人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋有限公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(货号：RR047A)与QPCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(货号：RR820L)均购自北京宝日医生物技术有限公司，RPS9抗体购自美国Abcam公司(货号：ab157125)，类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1(sentrin-specific protease 1，SENP1)(货号：11929)、P65(货号：8242)、磷酸化-P65(phosphorylation-P65，P-P65)(货号：3033)、抑制因子κBα(inhibitory subunit-κBα，IκBα)(货号：5209)、磷酸化-IκBa(phosphorylation-IκBa，P-IκBa)(货号：2859)、GAPDH(货号：5174)一抗以及相应二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司，细胞周期染色中高浓度碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自美国Sigma公司(货号：P4170)，膜联蛋白 V别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)/PI凋亡检测试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司(货号：AO2001- 11P-G)，CCK8细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学研究所(货号：CK04)，高灵敏化学发光检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司(货号：NCI5080)，实验中引物由华大基因合成，对照(control，CON)与RPS9-短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)购自美国Sigma公司，SENP1过表达载体购自北京义翘神州技术有限公司(货号：HG19083-UT)，慢病毒聚乙二醇沉降试剂购自美国System Biosciences公司(货号：LV825A- 1)。

细胞培养与分组健康志愿者与初治多发性骨髓瘤患者骨髓来自宁波市北仑区人民医院，人骨髓瘤细胞系RPMI8226来自北京协和细胞库，RPMI8226培养于1640(美国Gibico，货号：11875127)+10%胎牛血清(美国Gibico，货号：11573397)完全培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2，在RPS9敲低实验中，RPMI8226分别感染CON与RPS9-shRNA慢病毒，感染复数为10(病毒数目∶细胞数目=10∶1)。

CD138+细胞分离纯化健康志愿者与多发性骨髓瘤患者骨髓首先分离单个核细胞，将骨髓样本加入到淋巴细胞分离液中，1500 r/min 离心20 min，转子半径为116 mm，吸取单个核细胞层，多发性骨髓瘤单个核细胞随后使用CD138磁珠分选试剂盒进行分选，操作步骤按照试剂盒说明书进行，分离得到的CD138+细胞随后冻存或进行后续实验。

慢病毒包装与纯化包装病毒为CON与RPS9-shRNA病毒，包装体系为三代慢病毒包装，即PMD2.G(addgene 12259)∶psPAX2(addgene 12260)∶目的载体=1∶3∶4，使用脂质体 2000(赛默飞公司，货号：12566014)转染至293t细胞，转染步骤按照试剂说明书进行，并收集36、48以及72 h病毒上清，病毒上清随后使用聚乙二醇沉淀法进行纯化，操作步骤按照试剂说明书进行。

细胞凋亡检测细胞凋亡检测使用膜联蛋白 V APC/PI双染法检测，RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA 48 h后，使用100 μl 结合缓冲液重悬，并加入5 μl膜联蛋白 V APC抗体和5 μl PI染料，冰上孵育10 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，细胞最终凋亡的比例使用膜联蛋白 V APC阳性细胞比例判定，实验重复3次，并进行统计学分析。

细胞周期检测细胞周期检测使用高浓度PI染色法，RPMI8226 在感染CON与RPS9-shRNA 慢病毒48 h后，各取100万个细胞，最终使用300 μl 含有5%胎牛血清 的磷酸盐缓冲液重悬，随后加入700 μl 纯酒精，并固定至少过夜。加入RNA酶使得终浓度为1 μg/ml，37 ℃ 30 min后，加入PI染料，使得终浓度为50 μg/ml，避光孵育20 min后，使用流式细胞仪检测细胞周期的变化。

免疫印迹蛋白检测使用Western blot法，细胞在使用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，加入等体积的2×上样缓冲液，沸水浴15 min后，加入到Western 预制胶中，50 V恒压电泳，待溴酚蓝在分离胶与积层胶之间被压平后，140 V恒压直到溴酚蓝至分离胶底部。随后400 mA恒流1 h湿法转膜，使用Tris 盐缓冲液-Tween洗膜3次，使用5%牛血清白蛋白封闭2 h，并4 ℃过夜标记相应的一抗，室温30 min标记相应的二抗，最后使用高灵敏化学发光检测试剂盒发光液显色，胶片曝光，最终蛋白的表达量使用Image J软件进行定量。

实时荧光定量PCRmRNA表达量的变化使用实时荧光定量PCR方法进行检测，RPMI8226 CON 与RPS9-shRNA细胞总RNA首先使用Trizol法提取后，使用反转录试剂盒反转录为cDNA后，使用SYBR染料法检测目的基因的表达，其中内参GAPDH 引物序列为：GAPDH正向 5’-TATGCTCTCCTCATGCATTG- 3’，GAPDH反向 5’-GGGACGACCTTCGATCTACC- 3’，RPS9正向 5’-GTCTCGACCAAGAGCTGAAGCT- 3’，RPS9反向5’-GGTCCTTCTCATCAAGCGTCAG- 3’，SENP1 正向5’-CATTTCGCCTGACCATTACACGC- 3’ SENP1 反向5’-CACACTTGGCAAGCCCTTCTCT- 3′，反应体系与条件参照试剂盒说明书进行，以GAPDH基因为内参，使用2-△△Ct法定量，RPS9 Ct值-GAPDH Ct值后计算出RPS9相对于GAPDH的表达量，即-△Ct值，并使用RPS9-shRNA 组Ct值-RPS9-CON组Ct值，得到-△△Ct值后，计算2-△△Ct值得到相对表达量，实验重复3次。

细胞增殖检测细胞增殖检测使用CCK8法进行，RPMI8226 在感染CON与RPS9-shRNA 48 h后，铺于96孔板中，并设立0、24、48、72、96 h时间点，每个时间点均设立4副孔，每孔3000个细胞，分别于0、24、48、72、96 h时加入1/10体积的CCK8试剂，37 ℃避光孵育2 h后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度，并分别于0 h吸光度相除得到增殖指数。实验重复3次。

公共数据库分析公共数据集选取基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)的GSE19784数据集，此数据集包括320例新诊断的多发性骨髓瘤样本，测序平台为GPL570，数据集下载使用GEOquery进行，在得到数据后，使用preprocessCore包进行数据标准化，并使用survival包进行生存分析，基因之间的相关性分析使用R自带函数cor.test进行。

统计学处理数据均使用SPSS 20.0软件进行分析，zumicroarray数据使用R语言分析，版本为3.3.4。其中定量数据使用两独立样本t检验，多组数据比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

RPS9在多发性骨髓瘤细胞中的表达情况，以及与患者年龄、髓外浸润的相关性首先检测10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON)以及30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞的RPS9表达，结果表明CON与CD138+细胞RPS9 相对表达量分别为1.00±0.12 和 5.45±0.71，骨髓瘤患者CD138+细胞中RPS9表达量显著升高(t=4.291，P=0.0036)，蛋白检测结果表明在大多数CD138+样本中，RPS9高表达(图1A)。在GSE19784数据集中，RPS9与患者总体生存率相关[P=0.004，beta=0.26，HR(95%CI)=1.43(1.1～1.6)，wald=8.3](图1B)。在患者临床信息中，RPS9被证实在年老患者与髓外浸润阳性患者中高表达，提示RPS9可能为多发性骨髓瘤发病过程中的癌基因。

RPS9的敲低与人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226凋亡、增殖的关联在确定RPS9在骨髓瘤CD138+细胞中高表达后，构建RPS9-shRNA，并包装为慢病毒，人骨髓瘤细胞系RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48 h后，首先使用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白阳性细胞比例，以确定感染效率，结果显示相对于未感染病毒的RPMI8226，CON与RPS9-shRNA细胞绿色荧光蛋白+细胞比例均在90%以上(图2A)。提取出RPMI8226-CON与RPMI8226-RPS9-shRNA 总RNA与蛋白后，分别使用实时荧光定量PCR与Western blot检测RPS9表达的变化，结果显示在mRNA水平，CON与RPS9-shRNA的RPS9相对表达量分别为1.00±0.12和0.19±0.02，差异有统计学意义(t=6.963，P=0.0022)。在蛋白水平，RPS9-shRNA细胞中的RPS9显著降低(图2B)。在RPMI8226感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48 h后，CON与RPS9-shRNA组细胞膜联蛋白 V 阳性细胞比例分别为3.47±0.37 和 18.60±1.64，RPS9-shRNA组显著高于CON组(t=9.015，P=0.0008)(图2C)。在增殖中，CON组与RPS9-shRNA组在72 h时增殖指数差异有统计学意义(t=6.846，P=0.0024)(图2D)。在细胞周期中，CON与RPS9-shRNA组在感染病毒48 h时，G2期细胞比例分别为(29.28±3.42)% 和(10.43±1.43)%，CON显著高于RPS9-shRNA组，差异有统计学意义(t=9.329，P=0.0007)(图2E)。

RPS9对凋亡作用的机制确定RPS9抑制能够促进RPMI8226凋亡、抑制增殖后，找出GSE19784数据集中与RPS9表达相关的、并在类泛素蛋白修饰分子、泛素化通路中发挥功能的基因，最终确定为SENP1基因[r2(95%CI)=0.48(0.37～0.60)，t=9.92，P<0.0001]，与此同时RPS9表达与编码IκBα的NFKBIA基因呈现负相关[r2(95%CI)=-0.33(-0.46～-0.19)，t=6.34，P<0.0001](图3A)。提取RPMI8226 CON与RPS9-shRNA细胞总蛋白，并检测SENP1的表达，结果显示SENP1的表达显著降低(图3B)。随后构建SENP1过表达载体，并转染至RPMI8226-RPS9-shRNA细胞中，Western blot确定SENP1过表达的效率(图3C)。并检测CON组、RPS9-shRNA组、shRPS9-SENP1组核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路P65亚基以及抑制因子IκBα的表达，结果显示随着RPS9的抑制，相对于CON组，RPS9的抑制使P65亚基、IκBα磷酸化受到抑制，P65总表达量不变，而IκBα的表达则显著上升，与此同时，过表达SENP1能够使P65、IκBα磷酸化得到恢复，IκBα整体表达量下降(图3D)。而在SENP1过表达载体转染48 h后，检测CON组、RPS9-shRNA组、shRPS9-SENP1组凋亡水平的变化，3组膜联蛋白 V阳性细胞比例分别为2.00±0.11、18.29±1.86和8.19±1.36，单因素方差分析显示差异有统计学意义(F=36.32，P=0.0004)，CON组与RPS9-shRNA组相比差异有统计学意义(t=8.620，P=0.001)，RPS9-shRNA组与shRPS9-SENP1组相比差异有统计学意义(t=3.483，P=0.025)，相对于RPS9-shRNA组，SENP1的过表达使RPS9介导的凋亡减少(图3E)。

RPS9：核糖体蛋白S9；Mr：相对分子质量

RPS9：ribosomal protein S9；Mr：relative molecular mass

A.Western blot检测 RPS9 在骨髓瘤CD138+细胞中蛋白水平的表达；B.RPS9在GSE19784公共数据集中与患者总体生存率相关

A.Western blot was performed to detect RPS9 expression in multiple myeloma CD138+cells at protein level；B.RPS9 expression is related with patients’ survival rate in GSE19784 public dataset

图1RPS9在骨髓瘤CD138+细胞中高表达

Fig1RPS9 is highly expressed in myeloma CD138+cells

讨 论

多发性骨髓瘤中已知的异常信号通路包括NF-κB信号通路、蛋白酶体通路等[8]。核糖体蛋白在其他肿瘤中的作用已经得到证实，如在肝癌中，RPL36a表达显著升高并能够促进急性髓系白血病细胞的增殖[9]，而RPS3a则被证实在多种肿瘤如早幼粒白血病细胞、肝癌、卵巢癌中高表达[10]，RPS9属于核糖体蛋白S4P家族，RPS9与p53通路关系密切，能够通过p53通路调控肿瘤细胞衰老、分化[7]，而RPS9与多发性骨髓瘤之间的关系则报道较少。

由于骨髓瘤患者表现为异常的CD138+细胞聚集，因此，本研究首先检测了RPS9在CD138+细胞中的表达，结果表明RPS9在mRNA与蛋白水平均呈现高表达，而在骨髓瘤患者中，合并髓外病变的患者预后显著变差，患者总体生存率与无病进展生存期均显著下降。相对于无髓外浸润的骨髓瘤患者，RPS9在髓外浸润患者中的表达显著上升。在GSE19784公共数据集中，RPS9的高表达也与患者预后差显著相关，基于以上结果，能够得出RPS9可能为癌基因的结论。因此，随后本研究设计了RPS9-shRNA并感染骨髓瘤细胞，结果表明RPS9表达的降低能够促进细胞凋亡、抑制增殖，并使得RPMI8226细胞系G1期比例显著上升，G2期比例下降。因此得到结论，RPS9的抑制能够起到抑制肿瘤的作用，证实RPS9可能为肿瘤突变过程中的驱动基因。

CON：对照组；shRNA：短发夹RNA；shRPS9：RPS9-短发夹RNA；FL1-H：1通道-高度；SSC-H：侧向角通道-高度；GFP：绿色荧光蛋白；APC：别藻青蛋白；FL2-H：2通道-高度；PI：碘化丙啶；FL2-A：2通道-面积；a：P<0.01

CON：control；shRNA：short hairpin RNA；shRPS9：short hairpin RNA of RPS9；FL1-H：fluorescence 1-height；SSC-H：side scatter-height；GFP：green fluorescent protein；APC：allophycocyanin；FL2-H：fluorescence 2-height；PI：propidium iodide；FL2-A：fluorescence 2-area；a：P<0.01

A.CON与RPS9-shRNA慢病毒感染RPMI8226细胞系48 h后，流式细胞仪检测GFP+细胞比例；B.Western blot检测RPS9表达水平的变化；C.膜联蛋白V APC/PI双染法检测细胞凋亡的变化；D.CCK8法检测细胞增殖的变化；E.高浓度PI染色法检测细胞周期的变化

A.after CON and RPS9-shRNA lentivirus infected RPMI8226 cell line for 48 hours，the proportion of GFP+cells was detected by flow cytometry；B.Western blot was performed to detect RPS9 expression change；C.Annexin V APC/PI double staining was performed to detect apoptosis；D.CCK8 was performed to detect cell proliferation；E.high concentration PI staining was performed to detect cell cycle

图2RPS9促进人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226凋亡、抑制增殖

Fig2RPS9 promotes apoptosis and inhibits proliferation of human multiple myeloma cell line RPMI8226

RPS9基因本身相关的报道不多，在多发性骨髓瘤中蛋白酶体、NF-κB、类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)通路相互关联，且均与患者生存、预后显著相关。对GSE19784数据集进行分析后显示，RPS9的表达与SUMO解离酶SENP1以及NFKBIA(编码IκBα)基因的表达显著相关。NF-κB通路通常情况下两种亚基随机组成的二聚体与抑制因子如IκBα聚合从而不能发挥功能，在IκBα磷酸化后，IκBα随后与泛素分子结合从而降解，这一过程中SUMO分子能够与泛素分子竞争性结合[11]，而SENP1作为SUMO解离酶的一种，其活性的降低能够使细胞中SUMO结合的蛋白显著上升，进而抑制IκBα降解[12]。与此同时，本研究证实RPS9的抑制能够降低SENP1的表达，并使得P65亚基磷酸化降低，而总表达量不变，抑制因子IκBα磷酸化同时降低，而IκBα则表达量显著上升，表明RPS9的抑制使NF-κB通路受到抑制。而在过表达SENP1后，P65亚基、IκBα磷酸化均得到恢复，IκBα总表达量上升，表明RPS9对NF-κB通路的影响与SENP1相关。在过表达SENP1后，RPS9引起的凋亡增加同时受限，表明SENP1不仅是RPS9影响骨髓瘤通路的关键因子，同时也是RPS9发挥抑制凋亡功能的中介。而细胞生物学的改变是否由NF-κB通路的改变引起，以及RPS9对SENP1的调控具体机制仍需证明。

SENP1：类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1；NF-κB：核因子-κB；P-P65：磷酸化-P65；IκBα：抑制因子κBα；P-IκBα：磷酸化-IκBα

SENP1：sentrin-specific protease 1；NF-κB：nuclear factor-κB；P-P65：phosphorylation-P65；IκBα：inhibitory subunit-κBα；P-IκBα：phosphorylation-IκBα

A.在提取出GSE19784数据集基因表达量后，使用Pearson相关性检测RPS9与SENP1、NFKBIA之间表达的关系；B.RPMI8226细胞感染CON与shRPS9慢病毒后，Western blot检测SENP1蛋白水平的表达变化；C.RPMI8226-shRPS9细胞转染SENP1过表达载体后，Western blot检测SENP1蛋白水平的表达变化；D.Western blot检测RPMI8226-CON、RPMI8226-shRPS9和RPMI8226-shRPS9-SENP1细胞中，NF-κB通路P65、IκBα的磷酸化水平的变化；E.膜联蛋白 V APC/ PI 双染法检测凋亡水平的变化

A.after the expression values were extracted from GSE19784 dataset，Pearson correlation test was performed to confirm the relationships of RPS9 expression with SENP1 and NFKBIA expressions；B.after RPMI8226 cells were infected with CON and shRPS9 lentivirus，the expression level of SENP1 protein was detected by Western blot；C.after RPMI8226-shRPS9 cells transfected the SENP1 overexpression vector，Western blot was performed to detect SENP1 expression at protein level；D.the phosphorylation levels of P65 and IκBα in NF-κB pathway in RPMI8226-CON，RPMI8226-shRPS9，and RPMI8226-shRPS9-SENP1 cells were detected by Western blot；E.change of apoptosis level was detected by annexin V APC/ PI double staining

图3RPS9通过SENP1影响NF-κB通路以及细胞凋亡

Fig3RPS9 affects NF-κB pathway and apoptosis through SENP1

综上，本研究显示RPS9在多发性骨髓瘤患者中高表达，且与患者髓外浸润、预后显著相关。RPS9的抑制能够促进细胞凋亡、抑制增殖并促进细胞周期的阻滞。与此同时，RPS9能够通过SENP1影响骨髓瘤异常信号通路NF-κB的活性。表明RPS9在多发性骨髓瘤中起到促进作用且与NF-κB相关。RPS9作为一种研究较少的蛋白，在前人的研究中主要致力于和P53通路的相互作用，且与骨髓瘤的关联尚不清楚。本研究证实RPS9与骨髓瘤之间的关联，且证实与NF-κB通路相关。不足之处在于并未能够确定RPS9与SENP1的直接关联，在后期的研究中，可能需要通过免疫沉淀、点突变等方式进一步研究RPS9与SENP1之间的作用及其对NF-κB通路的影响。