糖尿病大鼠罗库溴铵神经肌肉阻滞作用的药效学

刘孝文，宫瑞松，刘 真，左 君，赵 晶

1中国医学科学院 北京协和医学院 研究生院，北京 1007302中日友好医院手术麻醉科，北京 1000293中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 1007304北京医院麻醉科，北京 100730

非去极化肌松药(non-depolarizing neuromuscular blocking agents，NMBAs)如罗库溴铵可产生骨骼肌松弛效应，是临床麻醉中辅助气管插管、充分暴露术野和机械通气的重要药物，其药代药效学特性受到年龄、体温以及多种疾病状态等诸多因素影响[1- 2]。糖尿病作为一种代谢性疾病，在早期即可损害神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)，并引起突触后烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)改变[3- 5]。糖尿病这些病理变化可能导致罗库溴铵等肌松药的药效学改变，但具体影响尚存在争议，因此也越来越得到关注[6- 11]。近年临床研究显示，糖尿病患者罗库溴铵起效时间和作用时间等时效参数指标与正常患者差异无统计学意义[10]。但另有研究显示，糖尿病患者应用罗库溴铵后4个成串刺激(train-of-four，TOF)的T4/T1比值(TOF ratio，TOFr)恢复至90%所需时间明显延长，提示糖尿病患者罗库溴铵药效增强[11]。而离体肌肉实验则证实，糖尿病导致骨骼肌对各种非去极化肌松药敏感性降低，表现为肌颤搐50%有效抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)明显增高[9]。为明确糖尿病对NMBAs药效的具体影响，本研究拟建立糖尿病大鼠模型，进行在体肌颤搐张力实验，按剂量累积法给予罗库溴铵，并通过机械肌动描记法(mechanomyography，MMG)记录肌松效应的时效参数，并计算获得量效参数指标，从而描述糖尿病病程中罗库溴铵诱导的胫前肌肌肉阻滞效应的变化。

材料和方法

实验动物及分组选取同种系SPF级成年雄性SD大鼠24只，体重200～250 g，由北京协和医院动物实验中心提供，并由固定培训合格人员进行饲养和管理。标准饲料、饮水、垫料等相关物品均经过无菌处理。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组。其中正常对照组6只，糖尿病组再分为造模后2、4和8周3个亚组，每亚组各6只。

动物模型建立大鼠禁食12 h后，参考文献方法[9，12]一次性给予腹腔注射链脲佐菌素(Sigma公司，美国)60 mg/kg(用0.1 mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液稀释)，诱导糖尿病大鼠模型，对照组则给予柠檬酸钠缓冲液(北京江晨文轩生物科技公司)进行等量注射。给药72 h后检测尾静脉血糖，血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功。如血糖<16.7 mmol/L，则继续注射链脲佐菌素重新造模。

在体胫前肌张力实验大鼠称重，腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠(Merck公司，美国)对大鼠进行麻醉，术中根据需要适量追加。将大鼠置于恒温解剖台(北京江晨文轩生物科技公司)，行气管切开，插气管导管后连接ALC-V8S小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)进行机械通气，设定潮气量为10 ml/kg，频率55～60 次/min，吸呼比为1∶2，氧流量0.5 L/min。打开RM6240型多道生理信号采集系统(成都仪器厂)，大鼠尾部热敷后放置尾压测定装置，并行尾静脉穿刺置管已备输液或给药。大鼠右后肢脱毛后剪开腹股沟皮肤，用玻璃分针分离暴露坐骨神经并放置电极线与神经刺激器相连。固定右肢，分离右胫前肌，离断远端肌腱并与肌张力换能器相连。采用连续TOF刺激右侧坐骨神经，具体参数为电压2 v，频率2 Hz，波宽200 μs，刺激间隔10 s[13]。记录胫前肌张力曲线，并在曲线稳定后按剂量累积法静脉给予罗库溴铵[默沙东(中国)有限公司]。罗库溴铵初始剂量为0.2 mg/kg，之后以0.1 mg/kg递增，最大剂量为1.2 mg/kg，均用生理盐水稀释至0.5 ml，并在30 s内匀速缓慢输入。TOF的第4个肌颤搐T4和第1个肌颤搐相同即T4=T1时方可给予下一个剂量。实验过程中间断向暴露处肌肉和神经喷洒Krebs液(中科迈晨科技有限公司)，以保持其湿润及活性。同时恒温解剖台保温，监测肛温，避免低体温出现，并每隔1 h进行血气分析。实验中肌张力及血压数值均由RM6240型多道生理信号采集系统记录。

药效学指标测定起效时间：给予肌松药后到T1产生最大抑制的时间；TOFr75时间：从给完肌松药到TOFr恢复到75%的时间；TOFr90时间：从给完肌松药到TOFr恢复到90%的时间。T1最大肌颤搐抑制：给予肌松药后，连续3次T1肌颤搐抑制达到最大时的肌张力抑制程度。采用Prism 6软件(GraphPad公司，美国)，根据罗库溴铵对数剂量及最大肌颤搐抑制，采用四参数模型拟合剂量效应曲线，并计算 IC50及其95%可信区间[14]。

统计学处理采用SAS 9.4软件(SAS Institute Inc.，美国)进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，时效参数指标的分析采用重复测量的方差分析，采用Macuchly test进行球形检验，对于不满足球形检验的数据采用Greenhouse-Geisser校正系数进行校正，进行不同剂量与分组的主效应及两者交互的分析，IC50的比较采用t检验[15]。组间两两比较结果均采用Bonferroni法进行两两校正。P<0.05为差异有统计学意义。采用Prism 6软件进行图像处理。

结 果

一般情况糖尿病组18只大鼠均建模成功并存活。造模2周组大鼠在张力实验前血糖水平为(24.48±3.88)mmol/L，较对正常照组(5.85±0.73)mmol/L明显增高(P<0.001)。随着造模时间延长，糖尿病4和8周大鼠血糖[(23.60±3.88)mmol/L和(25.80±4.09)mmol/L]与造模2周组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。另外，术中各组大鼠的血气分析结果、体温、心率及血压数值均在正常范围，未出现明显变化。

罗库溴铵起效时间随着罗库溴铵剂量增加，大鼠罗库溴铵起效时间逐渐缩短，差异有统计学意义(F=48.965，P<0.001)。与正常大鼠相比，糖尿病各亚组大鼠的罗库溴铵起效时间均显著延长，且随着造模时间延长，罗库溴铵起效时间进一步随之延长，差异均有统计学意义(F=92.88，P<0.001)，尚不认为不同组别与时间存在交互效应(F=1.72，P=0.078)(表1)。

TOFr75时间和TOFr90时间随着罗库溴铵剂量增加，各组大鼠罗库溴铵TOFr75时间逐渐延长，差异有统计学意义(F=890.188，P<0.001)。与正常大鼠相比，糖尿病各亚组大鼠的TOFr75时间缩短，且随着造模时间延长，TOFr75时间随之进一步缩短，差异均有统计学意义(F=112.815，P<0.001)，组别与剂量对TOFr75的影响存在交互效应(F=18.855，P<0.001)(表2)。随着罗库溴铵剂量增加，各组大鼠罗库溴铵TOFr90时间逐渐延长，差异有统计学意义(F=965.192，P<0.001)，与正常大鼠相比，糖尿病各亚组大鼠的TOFr90时间缩短，且随着造模时间延长，TOFr90时间随之进一步缩短，差异均有统计学意义(F=216.753，P<0.001)，组别与剂量对TOFr90时间的影响存在交互效应(F=22.095，P<0.001)(表3)。

罗库溴铵剂量效应根据罗库溴铵对数浓度和肌颤搐张力抑制水平得到的量效曲线显示，正常大鼠、糖尿病造模2、4及8周大鼠胫前肌的罗库溴铵IC50及95%可信区间分别为0.37(0.35～0.38)mg/kg、0.44(0.43～0.46)mg/kg、0.59(0.57～0.61)mg/kg和0.64(0.61～0.66)mg/kg。与正常对照组比较，糖尿病各亚组罗库溴铵IC50显著增加，而且随着糖尿病造模时间延长，罗库溴铵IC50进一步增加，差异均有统计学意义(P<0.001)。糖尿病导致罗库溴铵的剂量效应曲线右移(图1)。

讨 论

本研究采用腹腔注射链脲佐菌素的方法成功建立糖尿病大鼠模型，并通过在体给予罗库溴铵后胫前肌肌颤搐张力变化探究糖尿病对罗库溴铵量效指标和时效参数的影响。结果表明糖尿病导致大鼠胫前肌对非去极化肌松药罗库溴铵的敏感性下降，表现为量效曲线右移，TOFr恢复75%和90%的时间均增加，并且随着病程延长，罗库溴铵敏感性的变化越显著。

目前，有关糖尿病对NMBAs药效学影响的研究资料较为有限[6- 11]。Huang等[9]在大鼠离体趾长伸肌(extensor digitorum longus muscle，EDL)和比目鱼肌(soleus muscle，SOL)肌条中观察糖尿病对罗库溴铵、顺式阿曲库铵等NMBAs的药效学影响，在离体状态下，糖尿病4和16周大鼠EDL和SOL的罗库溴铵IC50均较正常大鼠明显升高，糖尿病16周大鼠EDL和SOL罗库溴铵IC50则较糖尿病4周大鼠升高更多，同时，他们还发现，糖尿病对NMBAs药效的影响并不因肌松药种类变化而改变。但是由于该研究是离体实验，不能完全代表在体量效指标，而且无法获得时效参数。本研究从在体动物水平观察糖尿病对罗库溴铵量效指标的影响，表明糖尿病引起罗库溴铵量效曲线右移，与上述离体研究的结果一致。本研究还进一步获得糖尿病大鼠罗库溴铵肌松作用的时效参数指标，发现随造模时间延长，罗库溴铵起效时间逐渐延长，TOFr75时间和TOFr90时间逐渐缩短，再次验证糖尿病可导致骨骼肌对罗库溴铵敏感性降低。

表1 不同组不同浓度下罗库溴铵起效时间(n=6，-±s，s)Table 1 The onset time of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

P1：造模2周组与正常对照组比较；P2：造模4周组与正常对照组比较；P3：造模8周组与正常对照组比较

P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

糖尿病患者NMBAs药效学变化的临床研究结果存在一些争议。Saitoh等[6]对2型糖尿病患者与非糖尿病患者使用维库溴铵进行对比观察，结果表明维库溴铵起效时间和TOFr恢复时间未受糖尿病影响，T1～T4和T1/T0所需的恢复时间明显延长，但糖尿病患者所需平均超强刺激电流明显更高。但Alper等[10]研究显示糖尿病患者罗库溴铵起效时间、作用时间、恢复指数(T1肌颤搐的幅度由25%恢复到75%的时间)与正常患者差异无统计学意义。另有研究显示糖尿病患者TOFr恢复至90%所需时间明显延长[11]。综合目前临床研究，似乎提示糖尿病可导致患者对NMBAs敏感性增强，而本研究的结果与之相反。可能的解释包括：(1)上述研究的临床样本均较小，肌松药剂量单一，无法有效排除各种混杂因素的影响。(2)上述研究采用的肌松监测手段都是肌电描记法，而糖尿病可对肌纤维电流产生影响，肌电描记法监测结果并不能取代MMG这一金标准来准确描述罗库溴铵诱导的肌颤搐张力变化情况[16- 17]。而本研究采用均质性较高的同源大鼠，给予多个剂量罗库溴铵，并采用MMG方法对肌颤搐张力变化进行描述，可避免一些潜在的混杂影响。

表2 不同组不同浓度下罗库溴铵TOFr75时间(n=6，-±s，s)Table 2 TOFr75 of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

TOFr75：从给完肌松药到4个成串刺激的T4/T1比值恢复到75%的时间；P1：造模2周组与正常对照组比较；P2：造模4周组与正常对照组比较；P3：造模8周组与正常对照组比较

TOFr75：the recovery time from rocuronium injection to train-of-four T4/T1 ratio 75%；P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

糖尿病影响骨骼肌对罗库溴铵敏感性的具体机制目前尚不清楚，考虑到NMJ是肌松药直接作用部位，糖尿病对NMJ的影响可能是造成上述现象的重要因素。有研究表明，在神经或肌肉复合动作(compound muscle action potential，CMAP)尚未受影响的糖尿病早期，NMJ即可受累[3- 5，18]。比如，糖尿病造模2周后小鼠即出现骨骼肌突触后膜nAChR损害[5]，糖尿病6周内即可检测到终板膜上运动单元减少[18]。另外，糖尿病小鼠突触前nAChR对乙酰胆碱敏感性增强[19- 20]，糖尿病小鼠突触间隙乙酰胆碱脂酶表达下降[21]，这些均有可能增强NMJ对乙酰胆碱的敏感性，进而影响非去极化肌松药的药效。鉴于糖尿病2周即可引起NMJ病变，而6周内对神经末梢和CMAP影响较小，本研究选择造模2、4和8周进行在体研究。然而，糖尿病是否影响突触后膜上nAChR亚型表达及其影响非去极化肌松药药效作用的具体机制尚不明确，后续本课题组将进行相关探索。

表3 不同组不同浓度下罗库溴铵TOFr90时间(n=6，-±s，s)Table 3 TOFr90 of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

TOFr90：从给完肌松药到4个成串刺激的T4/T1比值恢复到90%的时间；P1：造模2周组与正常对照组比较；P2：造模4周组与正常对照组比较；P3：造模8周组与正常对照组比较

TOFr90：the recovery time from rocuronium injection to train-of-four T4/T1 ratio 90%；P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

图1正常大鼠与糖尿病大鼠罗库溴铵量效曲线

Fig1Cumulative dose-response curve of rocuronium in the normal controls and diabetic rats

本研究尚存在一些不足之处。比如，本研究采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠为1型糖尿病模型，并不能完全模拟临床中常见的2型糖尿病。另外，与离体研究不同，为尽量避免肝肾损伤等靶器官损伤对时效参数的影响，本研究观察对象为相对早期糖尿病大鼠，时效参数结果尚无法反映疾病晚期情况。

综上，本研究结果显示，糖尿病可导致大鼠骨骼肌对罗库溴铵敏感性降低，表现为量效曲线右移，肌松作用显著下降，同时肌松起效时间延长，而恢复时间缩短。