组织蛋白酶B通过瞬时受体电位黏蛋白- 1对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体活化的影响

段娟娟，张启芳，黄宗华，曾红梅，柏 华，5，6

1贵州医科大学第三附属医院神经内科，贵州都匀 5580002贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵阳 5500043贵州医科大学教育部地方和少数民族疾病重点实验室，贵阳 5500044贵州医科大学第三附属医院检验科，贵州都匀 5580005贵州医科大学附属医院神经内科，贵阳 5500046贵州医科大学第三附属医院医学实验中心，贵州都匀 558000

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种老年人常见的痴呆类疾病，β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)与AD的发病关系密切[1]；Aβ有可能通过激活小胶质细胞中的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family and pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小体，导致脑内神经性炎症反应从而促进AD的发生和发展[2]。 BV2 细胞具备原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点，它是应用携带癌基因 v-myc 的反转录病毒J2 感染原代培养的小鼠小胶质细胞而获得的永生细胞，用活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)诱导剂过氧化氢(H2O2)诱导 BV2细胞产生的氧化应激损伤模型能够比较简洁和直观地用于研究AD等神经变性疾病[3]。组织蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一种存在于细胞溶酶体内的蛋白水解酶，它能催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解，细胞内外多种刺激因素可以引起溶酶体膜的通透性变化，导致CTSB从溶酶体释放进入胞浆，参与激活细胞凋亡通路[4]。有研究显示，CTSB活性与AD患者血液中的白细胞介素- 1β(interleukin- 1β，IL- 1β)和丙二醛水平呈正相关，但与AD患者血液中谷胱甘肽水平呈负相关，提示氧化应激通过上调CTSB的活性激活NLRP3[5]。在实验性大鼠心肌梗死模型中，CTSB的抑制剂环氧酶琥珀肽甲基酯[L- 3-trans-(propyl-carbamoyloxirane- 2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline methyl ester，CA- 074Me]通过NLRP3信号通路能够促进心肌重塑[6]。溶酶体破裂释放的内容物具有激活NLRP3炎症小体的作用，其中有可能主要是CTSB在起作用；CTSB可能是通过降解NLRP3的抑制蛋白再激活NLRP3炎症小体。另外，分布于溶酶体中的溶酶体离子通道蛋白-瞬时受体电位黏蛋白- 1(transient receptor potential mucolipin- 1，TRPML1)对细胞膜转运、细胞自噬、胞吞作用及维持离子平衡具有重要的作用。TRPML1受pH值和钙离子调节，并对钙离子具有通透性[7]。推测在某些AD的发病过程中可能有CTSB的参与，CTSB是NLRP3炎症小体活化的一种上游信号，这种活化需要TRPML1基因表达的增加和钙离子信号的介导。本研究拟探讨在细胞氧化应激模型和特异性沉默TRPML1基因后的BV2细胞模型中，CTSB对NLRP3炎症小体活化的影响以及TRPML1基因表达是否影响CTSB的变化。

材料和方法

细胞培养与分组小鼠BV2细胞(购自上海素尔生物科技有限公司)贴壁生长在含12%胎牛血清的RPMI1640培养基中(加低浓度的青霉素和链霉素)，置入37°C、5%CO2培养箱中培养，每4～6天传代1次，选取对数生长期细胞进行实验。实验分4组。第1组为PBS处理组，作为对照组，用PBS 5 ml孵育细胞20 min，随后提取细胞的RNA或总蛋白，或者按实验要求继续培养；第2组为H2O2处理组，单纯用0.5 mmol/L H2O2孵育细胞20 min，然后提取细胞的RNA或总蛋白。第3组为H2O2+GdCl3组，先用0.5 mmol/L的H2O2处理细胞20min，再换成2 mmol/L的GdCl3处理细胞15 min，最后进行细胞RNA或总蛋白的提取；第4组为H2O2+GdCl3+CA- 074Me组，先用5 μmol/L的CA-074Me预处理细胞10 min，接着加入0.5 mmol/L的H2O2共同处理细胞20 min，再换成2 mmol/L的GdCl3处理细胞15 min，最后进行细胞RNA或总蛋白的提取。如果分析细胞生长状况，则在上述处理结束后继续换成1640培养基按需要的程序培养。各处理组均需要加用100 ng/ml浓度的脂多糖(Sigma，Cat#：L6529)进行预处理2 h。

酶联免疫分析法检测细胞中的半胱天冬酶-1和IL- 1β蛋白检测均采用双抗体夹心酶联免疫法，酶联免疫分析试剂盒均购于上海岚派生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。使用BIO-RAD- 680型酶标仪，630/450 nm双波长测定光密度(optical density，OD)值，以OD值为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算样品浓度。每组检测重复5次，取平均值。

MTT比色法检测细胞生长活力将BV2细胞接种于96孔板，经各组试剂处理后，在培养基中加入1 g/L的噻唑蓝，37 ℃温育4 h，吸除培养基，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振荡10 min。实验操作时设置调零孔、对照孔和加药孔；调零孔加培养基、MTT、DMSO；对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、DMSO。用酶标仪在490 nm波长处检测每孔光密度，间接反应活细胞的数量，并作细胞生长曲线分析。以时间为横坐标、以紫外分光光度计所测得的OD值为纵坐标做生长曲线，每个时间点计数细胞7次。

质粒构建和细胞转染从NCBI 基因库中获得小鼠TRPML1基因的全序列，注意下游附近的20余个核苷酸，去除与其他基因有高度同源性的序列，探测目标序列为：5’-CCCACATCCAGGAGTGTAA- 3’ 。使用英杰生命技术公司(Invitrogen)专有的BLOCK-iT RNAi方案设计并合成两对干扰片段短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)1、shRNA2 和一对无关序列片段，由上海吉凯基因化学技术公司提供带有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性筛选标记的TRPML1基因沉默重组慢病毒颗粒慢病毒介导的带有TRPML1的shRNA(LV-shRNA-TRPML1)及对照空载体慢病毒介导的带有空载体的shRNA(LV-shRNA-NC)。取对数生长期的BV2细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种于6孔板中，1 ml/孔。按照LipofectamineTM- 2000说明书转染BV2细胞。转染24 h后更换培养基加G418进行抗性筛选；挑出单克隆，扩大培养，获得的转染细胞命名为Tr-si-BV2细胞，转染空载体所获得的细胞命名为si-Scr-BV2 细胞。BV2细胞(或si-Scr-BV2 细胞)和Tr-si-BV2细胞同时传代生长4～6 d后，提取总蛋白，再做蛋白免疫印迹检测分析鉴别相关蛋白表达量。用TRPML1 siRNA或Scramble(Scr)RNA转染BV2细胞60 h，再用0.3 mmol/L 的H2O2处理细胞3 h，用Western blot 检测CTSB表达。

Western blot检测NLRP3蛋白各组细胞达到处理时间后，将培养液吸弃，用预冷的PBS清洗1次，加入200 μl放射免疫沉淀实验细胞裂解液和苯甲基磺酰氟，放在冰面上裂解20 min，以12 000×g、4°C 离心10 min，吸取上清，BAC法进行蛋白定量检测。取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，先在80V电泳30 min，然后在120V电泳90 min，然后在250mA下电转膜80 min。用含有脱脂奶粉的、混有聚山梨醇酯20的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(10 mmol/L Tris-HCI+0.15 mol/LNaCl+0.1% Tween- 20)封闭60 min。加入适当稀释的一抗：1∶500的兔抗鼠CTSB抗体、1∶400的兔抗鼠TRPML1抗体、1∶500的兔抗鼠转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗体、1∶1000的兔抗鼠微管蛋白抗体、1∶1000的兔抗鼠甘油醛- 3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白抗体、1∶400的兔抗鼠组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)抗体、1∶500的兔抗鼠组织蛋白酶L(cathepsin L，CTSL)抗体、1∶500的兔抗鼠组织蛋白酶V(cathepsin V，CTSV)抗体，以检测上述相应的蛋白。4°C过夜，再加入相应的生物素化二抗，室温放置120 min；然后加入ABC复合物、室温放置30 min，再加入DAB显色液。以微管蛋白(tubulin)作为内对照，相同条件下重复3次。Western blot 检测结果的条带灰度用BIO-RAD公司的Quantity-One 分析软件。

实时定量PCR检测mRNA分别收集上述各处理组细胞低温保存备用。采用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒进行标本RNA的抽提，并按照逆转录试剂盒说明书进行操作，将RNA逆转录成cDNA。根据DNAMAN软件进行引物序列设计。NLRP3上游引物：5’-CCACAAGATCGYGAGAAAACCC- 3’，下游引物：5’-CGGTCCTATGTGCTCGTCA- 3’；TRPML1上游引物：5’-TCTTCCAGCACGGAGACAAC- 3’，下游引物：5’-AACTCGTTCTGC-AGCAGGAAGC- 3’。胱抑素C(cystatin C，Cys C)上游引物：5’-GATCGTAGCTG GGGTGAACT- 3’，下游引物：5’-CCTTTTCAGATGTGGCTGGT- 3’。β-actin上游引物：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA- 3’，下游引物：5’-GTCGGAGATT-CGTAGCTGGA- 3’。反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃，15 s变性、60 ℃ 1 min退火、60 ℃ 1 min延伸，40个循环。根据约定公式计算mRNA的相对表达量。以β-actin为内参照。

统计学处理应用SPSS l6.0统计软件分析实验数据，各组实验数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组内比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

NLRP3 mRNA的表达在BV2细胞各处理组中定量PCR结果显示，PBS组、H2O2组、H2O2+GdCl3组、H2O2+GdCl3+CA- 074Me组的NLRP3 mRNA 相对含量分别为：3.24±0.45、5.45±0.78、5.96±0.81、3.19±0.38；PBS组与H2O2组或H2O2+GdCl3组比较，NLRP3 mRNA 相对含量差异均有统计学意义(t=8.14，P=0.0012；t=8.79，P=0.0009)；H2O2组与H2O2+GdCl3+CA- 074Me组比较差异无统计学意义(t= 0.85，P=0.32)；H2O2+GdCl3组与H2O2+GdCl3+CA- 074Me组比较，差异有统计学意义(t= 5.18，P=0.037)。其余各组两两比较，差异均无统计学意义。

半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的变化情况ELISA检测显示，单纯使用H2O2组或H2O2+GdCl3处理组与PBS组(仅用PBS处理)比较，半胱天冬酶-1明显增加，差异有统计学意义(t=3.24，P=0.031)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me组与 H2O2+GdCl3组比较，差异有统计学意义(t=5.68，P=0.021)。H2O2+GdCl3组与PBS组比较，BV2细胞中IL- 1β蛋白表达差异有统计学意义(t=7.70，P=0.0036)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me组与 H2O2+GdCl3组比较，差异有统计学意义(t=3.08，P=0.036)；单纯H2O2处理组与PBS组比较差异无统计学意义(t=1.48，P>0.05)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me组与PBS组比较，差异无统计学意义(t=1.79，P>0.05)(表1)。

表1 BV2细胞中不同处理组半胱天冬酶- 1和白细胞介素- 1β的比较(-±s)Table 1 Levels of caspase- 1 and interleukin- 1β in BV2 cell from four groups(-±s)

与PBS组比较，aP<0.05，bP<0.01；与H2O2+GdCl3组比较，cP<0.05

aP<0.05，bP<0.01 compared with PBS group；cP<0.05 compared with H2O2+GdCl3group

细胞生长活力选择BV2细胞的4组处理细胞分析细胞生长活力，各组细胞在进行相应处理后，再转换成1640培养基培养5 d，每天观察细胞生长和细胞活力，用MTT法间接进行细胞计数，各组细胞每个时间点检测12次(有4个复孔并重复3次)，取平均值，并作图比较，结果显示H2O2+GdCl3组生长最慢，H2O2组生长较慢，H2O2+GdCl3+CA- 074Me组的细胞生长相对较快(图1)。组间方差分析显示H2O2+GdCl3组与PBS组比较差异有统计学意义(F=9.13，P=0.0065)，H2O2组与PBS组比较差异有统计学意义(F=5.27，P=0.026)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me组与PBS组比较差异无统计学意义(F=1.45，P>0.05)。

ROS影响溶酶体钙离子通道蛋白TRPML1和组织蛋白酶B的表达用不同浓度的H2O2处理BV2细胞6 h，分别用定量PCR方法检测TRPML1和Cys C的mRNA，用 Western blot方法检测TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白的表达，结果显示CTSB与TRPML1蛋白均有相似或同步的变化；200 μmol/L处理组与对照组比较，TRPML1 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义(t=5.54，P=0.006)；TRPML1蛋白表达相互之间的差异有统计学意义(t=5.69，P=0.0055)。 200 μmol/L处理组与对照组比较，CTSB蛋白表达相互之间的差异有统计学意义(t=6.34，P=0.004)。而50 μmol/L处理组或100 μmol/L处理组与对照组比较，同一蛋白或mRNA(CTSB或TRPML1)之间的差异均无统计学意义。用定量PCR方法检测Cys C mRNA 表达水平，结果显示各处理组与对照组之间差异均无统计学意义。CTSD、CTSL、CTSV各处理组与PBS组或同一蛋白酶各组之间蛋白表达比较，差异均无统计学意义(图2)。

图1MTT法检测BV2细胞不同处理组的细胞生长曲线

Fig1The cell growth curve of BV2 cells in different treatment groups(MTT method)

沉默TRPML1基因表达后对H2O2诱导的CTSB表达的影响采用Western blot 检测已经转染和进行了TRPML1基因沉默处理的BV2细胞(Tr-si-BV2)中TRPML1基因的表达，结果显示siRNA干扰组的TRPML1的蛋白质表达水平显著低于对照组(siScr组)；TRPML1蛋白表达与内参GAPDH蛋白比较，差异有统计学意义(t=6.04，P=0.0043)(图3A)。针对Tr-si-BV2细胞进行了CTSB蛋白表达的检测，Western blot分析显示H2O2处理组或H2O2+siScr处理组分别与PBS组比较，CTSB蛋白的表达均显著增加，差异有统计学意义(t=7.85，P=0.0018；t=7.65，P=0.002)。H2O2+siRNA处理组与H2O2处理组比较，CTSB蛋白的表达显著减少，差异有统计学意义(t=3.40，P=0.021)(图3B)。转录因子EB蛋白的表达显示，H2O2组(t=7.12，P=0.0001)、H2O2+TRPML1 siScr 组(t=6.95，P=0.0043)、H2O2+TRPML1 siRNA 组(t=3.17，P=0.026)与PBS组比较，差异均有统计学意义。

讨 论

NLRP3炎症小体的激活与许多慢性炎症和免疫异常相关疾病的发生相关。NLRP3是人类固有免疫中的重要模式识别受体，NLRP3与下游的接头蛋白凋亡相关斑点蛋白和效应蛋白半胱天冬酶一起组装形成NLRP3炎症小体，这一炎症小体对内源危险信号和外源微生物有应激感受作用[8]。通常认为 NLRP3炎症小体激活的始动因素有各种病理晶体和相关病毒，参与NLRP3炎症小体激活的机制涉及到线粒体损伤、活性氧激活、钾离子外流、溶酶体破裂、钙信号传输等多种因素[9]。β淀粉样蛋白通过激活小胶质细胞的NLRP3炎症小体，能够导致大脑内神经胶质细胞炎症反应，引起神经元变性和死亡，从而诱发AD[10]；CTSB通过与NLRP3上的亮氨酸富含重复区域结合以降解NLRP3的抑制蛋白，从而促进NLRP3与凋亡相关斑点蛋白和半胱天冬酶- 1的结合，并参与激活细胞凋亡相关通路[11]。本研究以CTSB作为切入点探索NLRP3炎症小体激活的新路径，并进一步追踪介导CTSB作用的信号蛋白。

小胶质细胞在AD的发病过程中既有可能被激活聚集到老年斑周围，试图吞噬Aβ 以抑制AD进展；也有可能分泌一些炎症性细胞因子，促进免疫性神经炎症反应和AD发病[12]。BV2细胞属于一种永生化的小胶质细胞，本研究处理分组首先考虑到需要用过氧化氢诱导BV2细胞氧化应激模型，接着考虑用钙敏感性受体激动剂GdCl3是否能够强化这种氧化应激反应，然后再加用CTSB抑制剂CA- 074Me观察是否能够部分阻滞上述氧化应激反应；实验的预处理使用脂多糖，是考虑到脂多糖能够诱导NLRP3蛋白或IL- 1β前体蛋白的表达增加，对活化NLRP3炎症小体有重要的辅助作用；实验完成后发现与预期的效果比较一致。关于NLRP3 mRNA的表达，本研究使用实时定量PCR方法进行检测，结果显示在BV2细胞中H2O2组或H2O2+GdCl3组均比PBS组明显增加，与国际同行的类似实验结果[4]基本一致。由于NLRP3炎症小体的活化不单纯是NLRP3的高表达，还涉及一些下游信号分子的活化或高表达[13]，本研究用ELISA方法检测了BV2细胞中 半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的变化情况，结果显示在BV2细胞中的H2O2组或H2O2+GdCl3组半胱天冬酶- 1蛋白的表达均比对照组明显增加；而在BV2细胞中的H2O2+GdCl3组的IL- 1β蛋白表达比对照组明显增加，H2O2组的IL- 1β蛋白表达比对照组无增加，提示在不同的BV2细胞中部分下游分子活化的时间可能有所滞后。

TRPML1：瞬时受体电位黏蛋白- 1；CTSB：组织蛋白酶B；CTSD：组织蛋白酶D；CTSL：组织蛋白酶L；CTSV：组织蛋白酶V：Mr：相对分子质量；与0 μmol/L H2O2组比较，aP<0.05，bP<0.01

TRPML1：transient receptor potential mucolipin- 1；CTSB：cathepsin B；CTSD：cathepsin D；CTSL：cathepsin L；CTSV：cathepsin V；Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01 compared with 0 μmol/L H2O2group

A.BV2 细胞用不同浓度H2O2处理6 h胱抑素C mRNA 水平；B.BV2 细胞用不同浓度H2O2处理6 h，TRPML1 mRNA水平；C.BV2 细胞用不同浓度H2O2处理6 h，TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白表达

A.cystatin C mRNA level in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；B.TRPML1 mRNA levels of BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；C.protein expressions of TRPML1，CTSB，CTSD，CTSL and CTSV in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours

图2过氧化氢作用于BV2细胞后对TRPML1蛋白和多种组织蛋白酶的影响

Fig2Effects of hydrogen peroxide on TRPML1 protein and various cathepsins in BV2 cells

CTSB通过Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制人类SHSY5Y细胞生长、诱导细胞凋亡发生[14]。有研究显示在BV2细胞中H2O2诱导IL- 1β的分泌是以NLRP3炎症小体依赖的方式进行；与正常对照组相比，AD患者血浆中的CTSB活性、IL- 1β和丙二醛显著升高[5]。CTSB作用于一定的底物后也能产生N-截短的聚谷氨酸-β淀粉样蛋白(poly-glutamate-beta-amyloid，pGlu-Aβ)，而pGlu-Aβ已被证明是多种形式的Aβ肽中神经毒性很强的肽。另外，CTSB抑制剂E64d能够降低pGlu-Aβ和其他相关Aβ肽的产生[10]；在针对神经性炎症的发生发展方面，推测CTSB抑制剂CA- 074Me与E64d可能有类似作用。笔者认为组织蛋白酶B 诱导的神经性炎症变化在本质上是一种免疫性炎症反应；免疫反应适当时可能具有神经保护作用，免疫反应过度时则会诱导或加重AD的发生。有学者通过对BV2细胞中不同处理组的细胞生长情况进行分析，认为CTSB对NLRP3炎症小体的激活调控需要钙离子信号的介导；然而，钙离子信号本身或可能通过其他途径的活化信号激活NLRP3炎症小体；钙离子信号的传导在上游、起始端到复合体的组装等环节均调节NLRP3炎症小体的活化[6]；推测在一定条件下，CTSB基因能够通过NLRP3炎症小体的信号通路调节BV2细胞的生长和凋亡。

siScr：小干扰；siRNA：小干扰RNA

siScr：small interfering scramble；siRNA：small interfering RNA

A.TRPML1 siRNA有效地沉默TRPML1表达；B.TRPML1 siRNA 显著抑制H2O2诱导的CTSB蛋白表达

A.TRPML1 siRNA effectively silenced TRPML1 expression；B.TRPML1 siRNA significantly inhibited the protein expression of H2O2-induced CTSB

图3沉默TRPML1表达水平影响H2O2诱导的转录因子EB蛋白和CTSB蛋白表达

Fig3Silencing of TRPML1 expression level affects H2O2-induced transcription factor EB and CTSB protein expressions

来自溶酶体的组织蛋白酶的分泌通过半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性途径参与溶酶体膜透化介导的细胞死亡。由溶酶体的破裂或者晶体的吞噬作用所触发的CTSB的释放将会导致NLRP3炎性小体的激活、并导致促炎细胞因子IL- 1β和IL- 18的分泌，这些作用过程与AD的发病有关[15]。Colletti等[16]认为溶酶体离子通道蛋白TRPML1的缺失很可能会导致CTSB依赖性的细胞凋亡；他们发现在TRPML1 基因被沉默后，溶酶体CTSB易位到细胞质中，由Bax介导而引发细胞凋亡；由于Bax活性的抑制不阻止CTSB的释放，表明该蛋白质位于CTSB的下游；推测细胞色素C的释放、线粒体的渗透和半胱天冬酶的切割是随后强化细胞凋亡发生的因素。本研究显示，ROS能上调溶酶体钙离子通道蛋白TRPML1和组织蛋白酶B的表达，当用不同浓度的H2O2处理BV2细胞时，发现CTSB与TRPML1蛋白均有相似或同步的变化；而在200 μmol/L处理组与正常对照组比较，TRPML1 mRNA表达明显增加，提示在BV2的氧化应激损伤模型中，CTSB对NLRP3炎症小体的活化作用有可能与TRPML1基因的表达相关联。胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，相关基因能在所有的有核细胞内以恒定速度持续转录与表达，并无组织特异性。本研究显示胱抑素C的mRNA 表达水平在处理组与对照组之间无差异。CTSB是一类半胱氨酸蛋白酶家族，在人体中有11亚类[17]，本研究显示H2O2显著上调TRPML1和CTSB表达，比较轻微上调CTSD表达，但不影响CTSL和CTSV；推测ROS可能是通过TRPML1激活CTSB而不破坏溶酶体膜，结果不涉及其他类型组织蛋白酶。推测H2O2处理BV2细胞时诱导的CTSB和TRPML1蛋白增加可能有一定的组织特异性。

CTSB在一定条件下具有活化NLRP3炎症小体的作用，这种作用是否受到溶酶体钙离子通道蛋白TRPML1的影响？Man和Kanneganti[18]认为，CTSB与TRPML1在溶酶体中通过相互作用，从而维持转录因子EB的抑制并降低自噬相关蛋白的表达。Qi等[19]研究显示CTSB的遗传缺失或药理学抑制将会通过下调雷帕霉素的作用或者通过TRPML1激活TFEB触发信号传导，导致溶酶体生物合成的增加和自噬作用的增强。本研究显示沉默TRPML1基因表达后能够抑制H2O2诱导的CTSB表达，H2O2处理组与正常对照组比较，CTSB或TFEB蛋白的表达均显著增加；而H2O2+siRNA 组与H2O2组比较，CTSB蛋白的表达显著减少。另外，Tseng等[20]研究显示溶酶体钙离子信号通过TFEB在人单核细胞中调节高葡萄糖介导的IL- 1β分泌。本研究在检测CTSB蛋白的同时同步检测TFEB，发现有类似的表达增强，进一步支持TRPML1基因沉默后的病理生理作用涉及到转录因子对CTSB基因的表达调控。总之，CTSB在小胶质细胞中通过钙离子信号通路的介导能够活化NLRP3炎症小体，通过抑制CTSB活性或沉默TRPML1基因的表达有可能控制ROS对神经性炎症的促进作用。