循环miR-155/PDCD4水平与冠状动脉病变严重程度关联研究

陆振涛，崔四龙，董艳彩

我国属于冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CAD）的高发地区，尤其是对于60岁以上的老年人群，已成为第一位的死亡原因[1]，如何防治CAD的发生和发展是一项长期且艰巨的任务。迄今为止，虽然CAD的发病机制尚不明确，但是众多学者普遍认可，冠状动脉（冠脉）斑块破裂致管腔狭窄或闭塞是引发急性冠脉事件的主要原因[2]。大量研究证实，急性冠脉事件的发生与冠脉狭窄程度密切相关[3]。因此准确判断冠脉病变程度是进行个体化防治CAD的关键环节。由巨噬细胞介导的炎症反应在急性冠脉事件发生、发展的各个阶段扮演着十分重要的角色；例如巨噬细胞分泌的炎性介质-程序性死亡因子4（PDCD4）可以激活Toll样受体4（TLR4）信号通路，从而促进巨噬细胞的脂质沉积[4]。因此PDCD4作为一种典型的促炎蛋白，可以抑制多种心血管细胞的增殖，并与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关[5]。另外，郑华锋等[6]通过细胞实验证实，PDCD4是血管内皮细胞中miR-155的重要靶基因，miR-155通过调节PDCD4表达抑制血管内皮细胞的凋亡过程。因此，本项研究旨在探讨外周血CD4+T细胞miR-155/PDCD4在CAD患者中的表达情况，以及对冠脉病变严重程度的潜在诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究人群选取2017年6月至2018年5月因不明原因胸痛于漯河市中心医院心内科住院并行冠脉造影（CAG）确诊为CAD的285例患者，其中男性161例，女性124例，年龄35～84岁，平均年龄为（65.34±10.87）岁。纳入标准：①符合《冠心病诊断与治疗指南（2014版）》关于CAD的诊断标准[7]：左冠状动脉的左前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠（RCA）及其主要分支中至少有1支血管腔狭窄程度≥50 %；②所有患者遵循自愿原则，并签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准的患者；②合并急性脑血管疾病、急/慢性感染、器质性心脏病变、严重肝/肾功能不全、恶性肿瘤者；③既往接受过静脉溶栓、介入、搭桥手术者。另外，选取同时期在我院因相同的胸痛症状就诊，进行CAG检查未发现结果异常，心肌酶和心肌肌钙蛋白检查呈阴性的50例受试者作为对照组纳入本项研究。其中男性25例，女性25例，年龄为35～80岁，平均年龄为（66.78±12.03）岁。健康对照组受试对象排除CAD、高血压等心血管疾病。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言标准，该研究方案经我院伦理委员会批准，且在充分告知可能存在的风险后与所有患者签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 CAG由2位介入专家进行操作。患者在检查前，适度放松手腕，自桡骨茎突上2 cm处行穿刺，经鞘管注射3000～6000 U肝素，对左右冠状动脉进行全方位拍片检查，采用DSA图像处理系统定量分析冠状动脉病变支数和狭窄程度。

1.2.2 血液样本集对照组受试者体检时或患者入院后立即采集外周静脉全血5 ml置于肝素钠真空采血管（美国BD公司）中，4 ℃静置1～2 h，2000 rpm离心5 min，离心半径为10 cm；取上清，移至另一RNase-free离心管中，12 000 rpm离心10 min，离心半径为10 cm；彻底去除细胞碎片和杂质，置于-80 ℃保存备用，用于提取总RNA。同时采集受试对象外周静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管中，2 h内送检。所有检验均由本院检验科完成。

1.2.3 CD4+T细胞提取采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取受试对象外周血单个核细胞（PBMC），严格按照Dynabeads® FlowComp™人CD4淋巴细胞磁珠分选试剂盒说明书操作分选。对分选出的CD4+T细胞进行台盼蓝染色细胞计数，取存活率＞90%的CD4+T细胞备用。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测miR-155和PDCD4 mRNA表达量采用TRIzol试剂盒（日本Takara公司）提取CD4+T细胞总RNA。采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。根据Taqma® MicroRNA reverse transcription kit和Taqman® MicroRNA assay kit试剂盒（日本Takara公司）说明书进行逆转录反应。将cDNA保存至-20 ℃保存备用。按照三步法进行PCR扩增。以组织cDNA为模板，以小分子U6作为内参，将20 μl反应体系置于37 ℃恒温水浴60 min，85 ℃维持5 s，加入去离子水至100 μl，各反应孔取2 μl进行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反应体系，95 ℃维持30 s预变性，95 ℃维持5 s，60 ℃维持30 s，循环45次。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。miR-155引物：F：5'-TGGCCTTGTACCGATTGCTG-3'；R：5'-GCTGCTCTTCCTTTCCTGTGTT -3'）；PDCD4 引物：F：5'-AACTGTGCCAACCAGTCCAA-3'；R：5'-TCTTCTCAAATGCCCTTTCATC-3'）。PCR结果判断：根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。

1.3 观察指标

1.3.1 病变支数根据冠脉病变的累积支数，将患者分为①单支病变组：前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠脉（RCA）中任1单支血管狭窄≥50 %；②双支病变组：LAD、LCX、RCA中任意两单支血管狭窄≥50 %或者左主干（LM）病变；③三支病变组：LAD、LCX、RCA均狭窄，或者LM合并RCA同时病变。

1.3.2 冠脉狭窄程度根据CAG检查结果，将患者分为①轻度狭窄组：LAD、LCX、RCA中的主支狭窄＜50%；②中度狭窄组：任一主支狭窄≥50%，但＜75%；③重度狭窄组：LM狭窄≥50%和/或任一主支狭窄≥75%。

1.3.3 Gensini评分[8]采用Gensini评分系统来评价冠状动脉病变程度：1分，狭窄＜25%；2分，25%～50%狭窄；4分：51%～75%狭窄；8分：76%～90%狭窄；16分：91%～99%狭窄；32分，100%狭窄。冠状动脉个段所占的系数：LM×5；前降支近、中、远段分别×2.5、×1.5、×1；第一及第二对角支分别×1、×0.5；回旋支近、中、远段分别×2.5、×1.5、×1；右冠近段、中段、远段、后降支、左室后支分别×1，所有病变得分相加为最后总分。根据Gensini评分，0～30分定义为轻度病变，31～60分定义为中度病变，＞60分定义为重度病变。

1.3.4 生化指标检测采用DXC800全自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FPG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等。

1.4 统计学方法将资料输入SPSS 17.0统计学软件进行处理分析，计数资料以（%）表示，采用χ2检验；所有计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，否则以中位数和四分位数间距表示；满足方差齐性的计量资料，两组间比较采用独立样本t检验，否则采用Mann-Whitney U秩和检验；多组间数据比较采用One-way ANOVA分析。采用二分类变量logistic回归模型分析CAD的危险因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线确定各指标的诊断价值，计算曲线下面积（AUC）。敏感度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%，Youden's指数=敏感度（%）+特异度（%）-100%。以P＜0.05为差异有统计学意义。统计学显著性差异检验均为双侧。

2 结果

2.1 两组受试对象一般临床资料比较两组患者年龄、性别组成、体质指数（BMI）、风险因素、TC、ALT、AST水平基本一致，无统计学差异（P＞0.05）。而与对照组受试者相比，CAD组患者TG、HDL-C、BUN、SCr、空腹血糖及CD4+T细胞miR-155、PDCD4 mRNA水平均较高，存在统计学差异（P＜0.05）（表1）。

2.2 二分类Logistic回归分析CAD发生的危险因素分析拟选择受试者的基础临床资料，以发生CAD作为因变量（CAD赋值为1，非CAD赋值为0），逐步纳入年龄、性别、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、BUN、SCr、空腹血糖、miR-155、PDCD4 mRNA变量，采用逐步向前回归模型分析CAD的危险因素。结果显示外周循环CD4+T细胞miR-155和PDCD4水平、TG水平、HDL-C水平、空腹血糖水平是影响CAD发生的独立危险因素（P＜0.05）（表2）。

2.3 不同冠脉病变支数CAD患者miR-155和PDCD4表达情况比较经CAG检查，112例为单支病变，97例为双支病变，76例为三支病变，比较三个亚组CAD患者外周血CD4+T细胞miR-155和PDCD4 mRNA表达水平，均存在统计学差异（P＜0.05）。且病变支数越多，miR-155和PDCD4 mRNA表达水平以及Gensini评分越高。尤其是三支病变亚组CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平以及Gensini评分明显高于其他两个亚组患者，有统计学差异（P＜0.05）（表3）。

表1 两组受试对象基本临床资料分析

2.4 不同冠脉狭窄程度CAD患者miR-155和PDCD4表达情况比较经CAG检查，88例为轻度狭窄，146例为中度狭窄，51例为重度狭窄，比较三个亚组CAD患者外周血CD4+T细胞miR-155和PDCD4 mRNA表达水平，均存在统计学差异（P＜0.05）。且冠脉狭窄程度越高，miR-155和PDCD4 mRNA表达水平以及Gensini评分越高。尤其是三支病变亚组CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平及Gensini评分明显高于其他两个亚组患者，有统计学差异（P＜0.05）（表4）。

表2 多因素logistic回归分析CAD发病的危险因素

2.5 不同冠脉病变程度CAD患者miR-155和PDCD4表达情况比较根据Gensini评分系统统计结果，125例为轻度病变，87例为中度病变，73例为重度病变，比较三个亚组CAD患者外周血CD4+T细胞miR-155和PDCD4 mRNA表达水平，均存在统计学差异（P＜0.05）。且病变程度越严重，miR-155和PDCD4 mRNA表达水平越高。尤其是重度病变亚组CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平明显高于其他两个亚组患者，有统计学差异（P＜0.05）（表5）。

2.6 ROC曲线分析miR-155/PDCD4对重度冠脉病变的诊断价值采用ROC曲线分别分析CAD患者入院当日外周循环血CD4+T细胞miR-155和PDCD4 mRNA表达水平对73例重度冠脉病变患者的早期诊断价值，结果显示，miR-155、PDCD4以及miR-155/PDCD4诊断重度病变的AUC均＞0.7（P＜0.05），预测价值较高，（表6、图1）。

3 讨论

CAD是威胁我国国民尤其是老年人群生命健康和生活质量的重大公共卫生安全问题。CAD的发病因素多样化，本项研究中，我们初步分析了影响CAD发生的相关因素，其中CAD组患者TG、BUN、SCr以及CD4+T细胞miR-155、PDCD4 mRNA水平均高于健康对照组，并且经多因素Logistic回归分析，发现miR-155和PDCD4水平、TG水平、空腹血糖水平是影响CAD发生的独立危险因素。吴舒窈等[9]学者去年曾对上海地区CAD、Scr、TC和血糖水平升高等都是是诱发CAD的危险因素。但是由于本项研究的目的并非是对影响CAD发病的危险因素进行大型流行病学统计分析，因此纳入的对照组人群数量较少，而且是选择因不明原因胸痛而入院就诊的非CAD患者作为对照组，最终并未得出年龄、性别组成、BMI等因素与CAD发病的关系，但是却证实，外周血CD4+T细胞miR-155和PDCD4 mRNA表达量是影响CAD发病的独立危险因素。

表3 不同病变支数CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平以及Gensini评分比较（±s）

表3 不同病变支数CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平以及Gensini评分比较（±s）

注：PDCD4：程序性死亡因子4；与单支病变亚组比较，aP＜0.05；与双支病变亚组比较，bP＜0.05

亚组别 n（例） miR-155 PDCD4 mRNA Gensini评分单支病变 112 1.02±0.18 0.55±0.12 39.65±8.28双支病变 97 1.63±0.24a 0.68±0.14a 44.59±8.91a三支病变 76 2.14±0.20ab 0.97±0.17ab 57.64±9.62ab F值 - 678.799 201.932 95.396 P值 - 0.000 0.000 0.000

表4 不同病变程度CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平比较（±s）

表4 不同病变程度CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表达水平比较（±s）

注：PDCD4：程序性死亡因子4；与轻度狭窄亚组比较，aP＜0.05；与中度狭窄亚组比较，bP＜0.05

亚组别 n（例） miR-155 PDCD4 mRNA Gensini评分轻度狭窄 88 1.47±0.24 0.61±0.17 34.21±9.78中度狭窄 146 1.70±0.21a 0.72±0.14a 47.40±10.64a重度狭窄 51 1.89±0.18ab 0.83±0.15ab 63.78±8.39ab F值 - 66.087 35.331 142.815 P值 - 0.000 0.000 0.000

miR-155位于人类21号染色体上B-cell Integration Cluster（bic）基因的第三个外显子内，是参与免疫调节、血管炎症反应的关键因子。国外有学者曾指出，miR-155可促使单核/巨噬细胞对脂质的摄取，以及粘附因子及趋化因子的表达[10]。另外，国内Qiu等[11]通过临床研究发现，在CAD患者外周血单核细胞及血清中miR-155的表达高于正常组，且急性心肌梗死患者外周血单核细胞及血清中miR-155的表达高于非急性心肌梗死患者，这与我们的研究结果基本一致。

CAD的发病机制一直是心血管领域的研究重点，但是一直尚未有明确定论；多项研究证实，由动脉粥样硬化引起的全身慢性炎症反应是CAD重要的发病基础之一[12]。有研究显示，CAD患者可激活CD4+T淋巴细胞，并促使大量炎症因子分泌，CD4+T淋巴细胞尤其是Th1细胞，是参与不稳定动脉粥样硬化斑块形成和破裂的关键因素[13]。而miR-155作为调控CD4+T淋巴细胞活化、分化、参与免疫炎症反应调节的关键基因，在CAD发生、发展过程中的作用值得研究。除此以外，今年有学者通过细胞和动物实验证实，miR-155可通过正性调控其靶基因PDCD4，从而过度激活血管炎症反应，加重冠脉粥样硬化性病变[14]。在本项研究中，我们发现，CD4+T细胞miR-155和PDCD4的表达量与冠脉病变支数、冠脉狭窄程度以及冠脉病变严重程度均密切相关。且随着冠脉病变程度的加重，CD4+T细胞miR-155和PDCD4的表达量逐渐增加。经ROC曲线分析，CD4+T细胞miR-155和PDCD4表达量可作为早期诊断CAD患者病变严重程度的重要指标。

PDCD4是上个世纪末由美国科学家Shibahara[15]发现的与细胞凋亡有关的一类基因，包括肿瘤细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞等。2014年，苏强等[16]发现负荷剂量瑞舒伐他汀可以通过抑制CD4+T淋巴细胞PDCD4的表达，从而降低不稳定心绞痛患者心肌的炎性反应。叶金善博士也通过动物实验证实，给予PDCD4－/－/ApoE－/－双敲除小鼠喂养高脂饮食后，与ApoE－/－敲除小鼠相比，其粥样斑块的面积缩小，这说明PDCD4具有促进动脉粥样硬化形成的作用[17]。而PDCD4是miR-155下游关键靶基因，通过激活PDCD1信号通路，进而影响巨噬细胞的炎症反应[18]。

综上所述，本项研究首次探讨了循环血CD4+T淋巴细胞miR-155/PDCD4的表达水平与CAD的发生以及冠脉病变程度的相关性，可作为早期诊断重度冠脉病变的潜在分子标志物，同时也为CAD的个体化治疗以及靶向药物的研发提供新的方向。