维生素D受体基因遗传变异对慢性变应性鼻炎的预警作用

陈赛明，周小柳，周利民，李志路，张云霞

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又称为过敏性鼻炎，表现为致敏个体再次接触变应原后，变应原与机体内炎性细胞表面的特异性IgE结合，导致机体出现鼻塞、流涕、喷嚏等一系列症状的慢性非感染性炎性反应[1]，表现为免疫性疾病的特点。而近些年来，维生素D在免疫性疾病中的调节作用日益受到重视，比如血清中维生素D的水平与AR的发生存在相关性[2]。维生素D受体(vitaminD receptor,VDR)是维生素D的活性形式发挥信号传导作用的关键成分，其结构及活性的改变都可能成为影响维生素D功能的重要因素[3]。近年研究表明，人群中基因多态性形式是形成个体差异和疾病发生的分子基础，可成为疾病发生和预警的标记[4]。VDR基因存在众多单核苷酸多态性(single nuclear polymorphism,SNP)位点，而关于其遗传多态性与AR的关联性研究较少。因此，笔者选择了VDR 5个SNP位点rs7975232、rs2228570、rs731236、rs1544410及rs11568820进行病例对照研究，以期探寻上述SNP位点与AR的相关性及预警价值。由于基因分型的方法不同，此文仅报道rs731236、rs1544410及rs11568820三个位点的研究结果。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年3月—12月海南医学院第一附属医院收治的94例变应性鼻炎患者作为试验组(AR组)，选择同期在医院健康体检的健康人113例作为健康对照组(HC组)。AR组男53例，女41例，年龄30～52(42.13±7.02)岁；健康对照组男70例，女43例，年龄30～50(41.25±6.88)岁。2组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已经医院伦理委员会批准，入选者知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 纳入标准：(1)所有AR患者均符合诊断标准[5]；(2)入选者近期未接受糖皮质激素、抗组胺药等药物治疗。排除标准：(1)变态反应性疾病史者；(2)血液病者；(3)寄生虫病史者；(4)合并哮喘、特应性皮炎等变应性疾病者；(5)自身免疫性疾病者。

1.3 基因分型方法 采集所有入选者EDTAK2抗凝血2 ml，取200 μl进行基因组DNA提取及质量鉴定。委托上海捷瑞生物工程有限公司对样本进行VDR基因多态性位点的分型。具体过程如下：合成引物P1(5′-GGTGGGATTGAGCAGTGA-3′)、P2(5′-TCTTGGCATAGAGCAGGTG-3′)进行PCR扩增包含rs731236的193bp的PCR片段；合成引物P3(5′-GTGTGCAGGCGATTCGTAGG-3′)、P4(5′-GGAAGAGGTCAAGGGTCACTG-3′)进行PCR扩增包含rs1544410的185bp的片段；合成引物P5(5′-GAGGGAGGGAGGAAGGAA-3′)、P6(5′-CTGTAGCAATGAAAGCAAACCA-3′)进行PCR扩增包含rs11568820的199bp的片段。纯化后分别对上述PCR产物进行延伸，延伸产物各取10 μl，利用美国ABI公司的3730XL基因测序仪进行序列测定及数据读取。

1.4 统计学方法 利用SNPStats软件进行分析，连锁不平衡分析采用Hardy-Weinberg模型，基因型分布频率采用Logistic 回归分析，基因型的组间差异用共显性、显性、隐性模型3个模型验证。利用SPSS 25.0软件对等位基因的分布频率进行χ2分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VDR基因3个SNP的基本信息 本研究选取3个SNP位点作为研究对象，根据NCBI(SNP)数据库中的信息，rs731236位于编码区内，存在T/C两种形态，其中T为野生型等位基因，全球发生频率为0.720，突变基因型C属于次要等位基因，全球发生频率为0.280；rs1544410和rs11568820属于内含子突变，均存在G/A两种多态性，前者野生型等位基因为G，全球发生频率为0.700，后者野生型等位基因为A，全球发生频率为0.543；在NCBI数据库给出的信息中，rs731236突变可能存在临床意义，而其他两个SNP位点的突变则未发现，见表1。

表1 VDR基因3个SNP位点的基本信息

注：本表信息提取于2018年10月18日NCBI(SNP)数据库

2.2 VDR基因3个SNP的基因型检测及与AR相关性分析 rs11568820在受试人群中均检测出GG、AG、AA 3种基因型,在AR组和对照组中的分布频率分别为29.8%/34.5%、51.1%/51.3%、19.1%/14.2%，SNPState在线分析结果显示共显性模型、显性模型、隐性模型的检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。rs731236和rs1544410在受试人群中均检测出野生型纯合子和杂合子2种基因型，rs731236野生型纯合子TT和杂合子CT在试验组和对照组中的分布频率分别为87.2%/90.3%、12.8%/9.7%,AR组中杂合子的发生频率高于对照组，说明突变可能与AR相关，但差异无统计学意义(P>0.05)；rs1544410的野生型纯合子GG和杂合子AG在AR组和对照组中的发生频率分别为90.4%/90.3%、9.6%/9.7%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 3个SNP位点等位基因发生频率及与AR相关性分析 rs11568820位点突变等位基因A在AR组中的分布频率高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。rs731236、rs154410两个多态性位点的等位基因分布频率组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，见表3。

3 讨 论

AR属于多基因遗传变态反应性疾病，并以嗜酸性粒细胞趋化、转移并聚集于鼻黏膜组织为主要病理学特征，同时可释放大量炎性介质进而加重鼻黏膜损伤[6]。研究表明，许多参与细胞增殖分化及凋亡的信号通路与AR的发生密切相关，例如Notch信号通路、维生素D信号通路，均可通过影响免疫细胞的生命活动而对鼻炎的发生发展产生密切调节和影响[7-8]。维生素D信号通路的主要成分包括维生素D结合蛋白(GC)、细胞色素P450家族成员(CYP2R1)、维生素D受体等。维生素D代谢通路除了影响钙磷代谢之外，还参与多种疾病的发生发展过程。乔俊英等[9]研究发现，适量1,25-(OH)2D3可能通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路在哮喘发病中起重要作用。桂明才等[10]则认为维生素D3可通过调控PI3K/AKT信号通路诱导喉癌细胞凋亡。

表3 维生素D受体3个SNP位点等位基因分布频率与AR关联性分析 [基因数(%)]

维生素D受体作为维生素D信号通路中的关键成分，其结构与功能对维生素D的代谢及功能发挥起着至关重要的作用。尤其是关于VDR基因多态性与疾病发生的相关性研究越来越多，有研究表明VDR受体基因多态性与北京地区老年男性原发性高血压的发生密切相关[11]，陈咏等[12]研究发现VDR多态性与多囊卵巢综合征的发生存在关联，王丽等[13]则研究了VDR受体基因多态性与鼻咽癌的关联性。

在本研究中，选择了2017年在医院住院治疗的AR患者及健康对照者进行对照研究，多态性位点rs11568820检测出野生型纯合子、杂合子、突变型纯合子3种基因型，而所选择的其他2个位点rs731236、rs1544410 则只检测出野生型纯合子及杂合子2种基因型。对rs11568820的3种基因型进行遗传学模型统计分析，结果表明共显性模型、显性模型、隐性模型组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对rs731236、rs1544410这2个位点进行统计学分析，结果表明差异亦无统计学意义(P>0.05)。此外，对AR组和健康对照组3个多态性位点的等位基因分布频率进行了分析，结果差异亦无统计学意义(P>0.05)。

表2 VDR基因多态性与AR的关联性分析 [例(%)]

rs11568820位于12号染色体(47908762)，该区域属于VDR基因的启动子区。NCBI数据库中有超过80条文献对该位点与血清维生素D的水平及疾病的关联性进行了研究。Yin 等[14]研究发现此SNP位点与中国人群的胃癌发生存在关联，Yang等[15]则发现该位点与中国华北地区人群的食管癌有关。这说明rs11568820可能通过影响VDR的表达而影响维生素D信号通路的作用。本研究首次报道了rs11568820与变应性鼻炎的关联性，结果表明,3种基因型在2组中的分布频率并未呈现统计学差异，提示该位点的多态性与慢性变应性鼻炎的关联性不强。

rs731236属于VDR编码区密码子的同义突变，目前NCBI的数据库中有超过200条文献报道了该位点与机体性状及疾病的关联性。rs1544410属于VDR编码基因的内含子突变。Tian等[16]在2015年报道了关于上述2个SNP位点与中国人群AR的关联性研究，未发现显著关联性。本次针对rs731236及rs1544410的研究也未发现与AR的关联性，这与Tian等的研究结果一致，同时也提示rs731236碱基的形态变化未影响密码子的功能及蛋白质的结构，而内含子突变rs1544410也未对VDR的表达产生影响。

综上，本研究的3个多态性位点在慢性变应性鼻炎患者及健康对照者之间的基因型分布频率、等位基因分布频率均不存在统计学差异，说明这些位点不是慢性变应性鼻炎的易感位点。因而，在后续的研究中，一方面建议增加研究对象的数量，另一方面建议选取更多的SNP位点进行研究，以期寻找AR的易感SNP位点，从而为其诊断及预警机制的构建提供依据。

利益冲突：无

作者贡献声明

陈赛明：设计研究方案，监督实施过程，论文撰写；周小柳、周利民：实施研究过程，资料搜集整理；李志路：进行统计学分析；张云霞：提出研究思路，分析试验数据，论文修改、审核