H型高血压合并脑梗死患者ALDH2基因多态性与Hcy代谢、炎性反应及氧化应激状态的相关性

刘春苗，杨国帅，钟伟，余丹

急性脑梗死是临床常见的脑血管疾病，而H型高血压即血同型半胱氨酸(Hcy)水平≥10 μmol/L的高血压，是急性脑梗死发生的重要危险因素[1-2]，但关于H型高血压合并急性脑梗死发生的调控机制仍未明确。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是ALDH家族19个成员中催化活性最强的成员，能够将乙醇代谢产物乙醛脱氢氧化为乙酸，在乙醇的代谢过程中起到关键作用。近年来关于ALDH2的研究认为，该代谢酶不仅参与乙醇的代谢，还与体内Hcy、胆固醇等多种物质的代谢有关，其催化活性发生改变会增加代谢性疾病的发生风险[3-4]。ALDH2基因编码第487位氨基酸的密码子存在多态性，从鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)后会改变ALDH2的催化活性，国内王洪巨等[5]报道，ALDH2基因G487A突变会增加冠心病合并糖尿病患者高血压的发生风险，但关于ALDH2基因G487A突变与H型高血压合并脑梗死的关系尚未明确。现分析 H型高血压合并脑梗死患者ALDH2基因多态性及其与Hcy代谢、炎性反应、氧化应激状态的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年6月—2018年2月海口市人民医院神经内科诊治高血压合并急性脑梗死患者106例作为研究对象，根据入组时Hcy水平分为观察A组(Hcy<10 μmol/L)42例、观察B组(Hcy≥10 μmol/L)64例，另取同期于医院体检的健康者50例作为健康对照组。观察A组42例，男24例，女18例，年龄44～65(54.48±7.63)岁；发病至入院时间3～12(5.51±0.83)h；高血压病史1～8(4.23±0.73)年；合并糖尿病17例，高脂血症23例；既往接受阿司匹林治疗26例、他汀类药物治疗21例。观察B组64例，男35例，女29例，年龄42～67(55.12±8.61)岁；发病至入院时间4～13(5.83±0.91)h；高血压病史1～11(4.42±0.72)年；合并糖尿病24例，高脂血症29例；既往接受阿司匹林治疗38例，他汀类药物治疗32例。健康对照组50例，男28例，女22例，年龄40～65(53.94±8.42)岁。3组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，入选者和/或家属同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①经头颅磁共振及弥散加权像诊断为急性脑梗死；②既往有高血压病史；(2)排除标准：①既往有脑梗死、脑出血等病史的患者；②合并冠心病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤的患者；③正在服用叶酸、维生素B12等影响Hcy代谢的药物的患者。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 ALDH2基因多态性检测：入院次日或体检当日清晨取受试者静脉血2 ml枸椽酸钠抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞，使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。目的DNA片断扩增引物：上游引物5' -GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3'，下游引5' -CCACCAGCAGACCCTCAAG-3'。反应体系50 μl：模板DNA 2 μg、2XMaster Mix 25 μl、引物各2 μl、双蒸水补足至50 μl。反应条件：94℃预变性3 min后进入循环 94℃变性45 s，60℃退火30 s,72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增产物为200 bp。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴乙啶染色，紫外线分析凝胶成像系统下观察电泳结果。将目标条带切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将PCR产物纯化，由济南博亚生物技术有限公司提供目的基因片段测序，判断ALDH2的多态性。

1.3.2 Hcy代谢、炎性反应及氧化应激血清指标检测：观察A组、观察B组患者于入院后采集肘静脉血，健康对照组于体检时采集肘静脉血，离心分离血清，-80℃备用。(1)Hcy代谢指标：采用酶循环法试剂盒(北京世纪沃德生物公司)测定Hcy含量，采用酶联免疫吸附试剂盒(上海西唐生物公司)测定叶酸(FA)及VitB12含量。(2)炎性反应指标：采用酶联免疫吸附试剂盒(上海西唐生物公司)测定白介素-6(IL-6)、IL-8含量。(3)氧化应激指标：采用硫代巴比妥酸法试剂盒(南京建成生物研究所)测定丙二醛(MDA)含量，采用比色法试剂盒(南京建成生物研究所)测定总抗氧化能力(T-AOC)含量。操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 ALDH2基因G487A多态性比较 健康对照组ALDH2基因野生型GG的构成比为84.0%(42/50)、突变型GA+AA基因型的构成比为16.0%(8/50)；观察A组分别为61.9%(26/42)、38.1%(16/42)；观察B组分别为37.5%(24/64)、62.5%(40/64)。与健康对照组比较，观察A组和观察B组患者ALDH2基因GG的构成比明显较低、GA+AA构成比明显较高(χ2/P=5.779/0.016、24.899/0.000)；与观察A组比较，观察B组患者ALDH2基因野生型GG的构成比明显较低、突变型GA+AA的构成比明显较高(χ2/P=6.061/0.014)。

2.2 血清Hcy、FA、VitB12含量比较 与健康对照组比较，观察A组和观察B组患者血清Hcy含量均明显升高，FA、VitB12含量均明显降低(P<0.01)；与观察A组比较，观察B组患者的血清Hcy含量明显升高，FA、VitB12含量均明显降低(P<0.01)，见表1。

2.3 血清炎性反应及氧化应激指标比较 与健康对照组比较，观察A组和观察B组患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量均明显升高，T-AOC含量均明显降低(P<0.01)；与观察A组比较，观察B组患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量明显升高，T-AOC含量明显降低(P<0.01)，见表2。

2.4 观察B组不同ALDH2基因型患者血清Hcy代谢、炎性反应及氧化应激指标比较 与观察B组ALDH2基因GG基因型比较，GA+AA基因型患者的血清Hcy、IL-6、IL-8、MDA含量均升高，FA、VitB12、T-AOC含量均降低。见表3、4。

3 讨 论

H型高血压是急性脑梗死发生的重要危险因素，Hcy含量的升高以及血压的升高参与了颅内动脉粥样硬化的进程并增加了脑梗死的发生风险[6]。ALDH2是参与乙醇代谢的催化酶，近年来也发现该催化酶与胆固醇、Hcy等物质的代谢有关。ALDH2基因在G487A位点的多态性会影响其催化活性，国内学者的研究报道，ALDH2基因编码第487位氨基酸的密码子发生G向A的突变会使编码产物的催化活化发生改变，进而参与多种代谢性疾病及心脑血管疾病的发生[7-8]。本研究首先分析了高血压合并脑梗死患者体内ALDH2基因G487A多态性的变化，观察A组和B组患者的野生型GG的构成比明显降低、突变型GA+AA的构成比明显升高，这一结果与报道的在冠心病及心肌梗死患者中的研究结果一致，本研究结果表明ALDH2基因G487A突变的增多与高血压合并脑梗死的发生有关。在此基础上进一步分析H型高血压合并脑梗死患者与普通高血压合并脑梗死患者ALDH2基因G487A多态性的差异，合并H型高血压的观察B组患者野生型GG的构成比明显降低、突变型GA+AA的构成比明显升高，提示ALDH2基因G487A突变的增多可能影响Hcy代谢并参与H型高血压合并脑梗死的发生。

表1 3组受试者血清Hcy、FA、VitB12含量比较

表2 3组受试者血清炎性反应及氧化应激指标比较

表3 观察B组中不同ALDH2基因型患者Hcy、FA、VitB12含量比较

表4 观察B组中不同ALDH2基因型患者炎性反应及氧化应激指标的比较

Hcy是体内甲硫氨酸代谢循环中的产物，FA和VitB12是Hcy代谢所需的辅因子[9-11]，H型高血压以体内Hcy的增多为特征，有研究表明，当患者体内Hcy代谢所需的辅因子缺乏时，Hcy代谢受阻并在体内蓄积，进而通过诱导炎性反应、氧化应激反应等造成动脉内皮损伤、粥样斑块形成并参与脑梗死的发生[12-14]。本研究对H型高血压合并脑梗死患者体内Hcy代谢情况的分析发现：观察B组患者的血清Hcy含量均明显高于观察A组和健康对照组，FA和VitB12含量均明显低于观察A组和健康对照组，这一结果与国内相关报道一致，提示Hcy代谢所需辅因子的减少、Hcy在体内的蓄积参与了H型高血压合并脑梗死的发生[12-13]。在此基础上，为了进一步明确ALDH2基因多态性在H型高血压合并脑梗死患者体内Hcy代谢过程中所起的作用，本研究分析了观察B组中不同ALDH2基因型患者体内Hcy代谢指标的差异，突变型GA+AA患者的血清Hcy含量明显高于野生型GG患者，FA和VitB12含量均明显低于野生型GG患者，提示ALDH2基因G487A突变的增多能够影响Hcy的代谢，进而通过Hcy的生物学特性参与H型高血压合并脑梗死的发生。

Hcy具有诱导炎性反应及氧化应激反应的作用，炎性反应激活过程中产生的炎性反应介质以及氧化应激反应激活过程中产生的氧自由基能够引起血管内皮损伤、粥样斑块形成，与脑梗死的发生密切相关[15-18]。IL-6和IL-8是重要的炎性反应介质，具有强大的促炎活性，能够促进炎性反应细胞在血管内膜浸润并形成粥样斑块[19-21]；MDA是氧自由基与内皮细胞膜中脂质成分发生氧化反应的产物，T-AOC则是抗氧化的总能力，两者共同反映了氧化应激的程度[22-23]。本研究对H型高血压合并脑梗死患者体内炎性反应及氧化应激反应指标的分析发现，观察B组患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量明显高于观察A组和健康对照组，T-AOC含量明显低于观察A组和健康对照组，提示炎性反应及氧化应激反应的过度激活参与了H型高血压合并脑梗死的发生。在此基础上，为了进一步明确ALDH2基因多态性在H型高血压合并脑梗死患者体内炎性反应及氧化应激反应激活中所起的作用，本研究分析了观察B组中不同ALDH2基因型患者体内炎性反应及氧化应激指标的差异，突变型GA+AA患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量均明显高于野生型GG患者，T-AOC含量均明显低于野生型GG患者，提示ALDH2基因G487A突变的增多能够造成炎性反应和氧化应激反应的过度激活。

综上所述，ALDH2基因G487A突变与H型高血压合并脑梗死的发生及Hcy代谢紊乱、炎性反应及氧化应激过度激活有关。

利益冲突：无

作者贡献声明

刘春苗：负责研究构思，选择课题，课题设计，论文撰写；杨国帅、钟伟：负责数据获取，统计分析并参与撰写；余丹：负责研究方案指导，论文修改