奥美沙坦酯对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用及对肾组织Nephrin、VEGF表达的影响

朱晓娜，王玉环，吴娟娟，董鹏，张敏

(1西安交通大学第二附属医院，西安710004；2西安医学院第一附属医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病主要的微血管并发症之一，也是糖尿病患者致残率、致死率不断上升的主要原因。微量白蛋白尿或蛋白尿是DN最早出现的临床症状，其发生机制目前尚不清楚。越来越多的证据表明，肾小球足细胞损伤与DN进展性蛋白尿的产生密切相关。研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)可影响足细胞Neohrin的表达，诱导足细胞足突融合。肾素-血管紧张素系统激活与DN的进展关系密切，其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在DN的发病机制中起重要作用[1,2]，早期使用 AngⅡ受体抑制剂(ARBs)可预防和改善DN患者蛋白尿的出现。2011年新英格兰杂志发表的ROADMAP研究显示，奥美沙坦酯可延缓或者预防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的发生[3]；DN动物实验研究显示，早期使用ARBs对DN蛋白尿的改善作用可能与其对足细胞的保护作用有关[4,5]。2014年1月～2015年12月，我们观察了奥美沙坦酯干预对DN大鼠肾脏的保护作用，并通过观察肾组织足细胞标志性蛋白Nephrin和VEGF的表达变化，探讨其保护肾脏功能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物准备 健康雄性8周龄SD大鼠共30只，购于西安交通大学医学院实验动物中心(许可证号SCXK陕2007-001)，清洁级，体质量180～220 g。每笼5只，饲养于SPF标准实验室，温度(23±2)℃、湿度55%±5%，每日12 h光照维持昼夜循环，自由进食饮水，每日更换垫料、饲料及饮水。所有动物实验得到西安交通大学实验动物管理委员会许可，动物实验过程符合《西安交通大学动物实验管理指南》。

1.2 动物分组与造模 将大鼠普通标准饲料适应性饲养1周后随机分为NC组10只和实验组20只。实验组腹腔注射1% 链脲佐菌素(STZ) 65 mg/kg(Sigma公司，避光溶解于0.1 mmol/L pH 4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)，NC组腹腔注射同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后禁食尾静脉取血，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L为造模成功；注射STZ 4周后，代谢笼内收集24 h尿液检测尿蛋白，并尾静脉取血检测FBG、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。造模过程中实验组大鼠FBG不达标2只，DN造模成功18只。

1.3 药物干预 将实验组DN造模成功的18只大鼠随机分为两组各9只，DN组予以0.5%羟甲基纤维素钠灌胃，OM组予以奥美沙坦酯(Melone公司)10 mg/kg溶解于0.5%羟甲基纤维素钠灌胃；从第4周起开始干预，共干预8周。

1.4 肾脏功能指标检测 干预8周后，代谢笼内收集24 h尿液检测尿蛋白，禁食不禁水后尾静脉取血检测Scr、BUN。

1.5 肾组织病理观察 腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠，暴露腹腔，用DEPC水处理过的手术器械取出左右肾脏，冰盒上清除肾脏表面包膜及周围游离结缔组织。将左肾沿横截面切开后置于4%甲醛溶液中固定保存，右肾放入冻存管并置于液氮中保存。取大鼠左肾组织进行石蜡包埋切片，进行HE和PAS染色，观察肾组织病理变化。

1.6 肾组织VEGF、Nephrin mRNA检测 采用RT-PCR法。取大鼠右侧肾皮质，用TRIzol法提取总RNA；进行逆转录反应，所得产物以实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)行实时定量荧光PCR反应。反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s, 40个循环，56 ℃(GAPDH，Nephrin)/58 ℃(VEGF)40 s退火。引物由上海捷瑞生物公司设计合成：GADPH上游引物5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′、下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，VEGF上游引物5′-TTCGTCCAACTTCTGGGCTCTT-3′、下游引物5′-CTCCTCTTCCTTCTCTTTCTCCC-3′，Nephrin上游引物5′-TGTGTACCTGGGGTCTTGGA-3′、下游引物5′-AGGACTGGTTCGTCTTGTCG-3′。以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.7 肾组织VEGF、Nephrin蛋白检测 采用Western blotting法。取大鼠右侧肾皮质50 mg，加入蛋白裂解液RIPA研磨后冰上静置30 min；4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，上清液即为蛋白产物。采用BCA法测定蛋白浓度后，以1∶4的比例加入5×Reducing Sample Buffer；混匀后离心，100 ℃加热3 min变性。采用10% SDS-PAGE凝胶恒压120 V电泳90 min，使用PVDF膜在恒流200 mA并且冰袋降温的条件下转膜2.5 h。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜4次后一抗稀释(1∶2 000，Proteintech公司)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次后二抗稀释(1∶5 000，Santa公司)37 ℃孵育2 h。TBST洗膜4次后，膜上滴加ECL发光液；置于化学发光检测系统曝光5 min，记录存储图片，以目的条带与内参β-actin灰度比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组肾脏功能指标比较 见表1。

表1 各组24 h尿蛋白、Scr、BUN比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与DN组比较，#P<0.05。

2.2 各组肾组织病理情况 NC组肾脏组织结构清晰可见，球囊壁光滑，毛细血管及系膜细胞、系膜基质分布正常，基底膜未见增厚；DN组肾脏组织可见不同程度的基底膜增厚、系膜基质的增加，部分肾脏组织还可见肾小球内毛细血管扩张、肾小球硬化、肾小囊裂隙样改变以及肾小管上皮细胞的颗粒样变性和空泡样改变；OM组肾小球基底膜增厚及系膜基质增加的程度较DN组减轻。

2.3 各组肾组织Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表达比较 见表2。

表2 各组肾组织中Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表达比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与DN组比较，#P<0.05。

3 讨论

肾素-血管紧张素系统激活与DN的进展关系密切。肾素主要由肾脏产生，进入血液循环后可将血管紧张素原水解为AngⅠ，AngⅠ可在血管紧张素转换酶(ACEI)作用下水解为AngⅡ，AngⅡ主要是通过激动血管紧张素受体AT1发挥作用。AngⅡ在DN蛋白尿的发病机制中起重要作用[1,2]。通过对糖尿病患者及动物模型的研究发现，ARBs类药物可降低蛋白尿，对肾脏有一定保护作用[6,7]。奥美沙坦酯是一种新型ARBs，与传统ARBs相比其突出的特点是高度选择性。它可以与AT1的2个位点结合，一个是-OH，另一个是-COOH，而其他ARBs只与AT1的-OH结合。因此，奥美沙坦酯的作用更加持久稳定。2011年新英格兰杂志发表的ROADMAP研究发现，通过对4 447例2型糖尿病患者随机、双盲、多中心临床对照试验，发现奥美沙坦酯治疗组及安慰剂治疗组蛋白尿发生率分别为8.2%和9.8%，奥美沙坦组发生微量白蛋白尿时间延长23%,显示奥美沙坦酯可延缓或预防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的发生[3]。在糖尿病动物实验中也同样发现，奥美沙坦酯可明显降低糖尿病大鼠尿蛋白，改善肾脏功能[8]。在本研究中我们发现，给予奥美沙坦酯灌胃治疗后，DN组尿蛋白减少，Scr、BUN降低。这些与上述文献报道结果一致，提示奥美沙坦酯有一定的肾脏保护作用。

目前，人们普遍认为肾小球足细胞损伤在DN的发生发展中起着重要作用。足细胞损伤受各种理化因素影响，足细胞裂孔隔膜上表达的各种蛋白分子均可作为其损伤的标志物。Nephrin是调节足细胞裂孔隔膜结构和功能的重要蛋白，可影响肾小球滤过膜的通透性及蛋白尿的产生。在对包括DN在内的一些肾脏蛋白尿疾病患者及动物模型的研究中发现，肾小球Nephrin mRNA及蛋白质的表达水平下降，且在肾小球足细胞足突融合和消失及蛋白尿出现之前就出现明显下降。体外足细胞实验还发现，在鱼精蛋白诱导的足细胞损伤足突融合过程中，Nephrin蛋白的磷酸化较正常足细胞增多。自从将Nephrin蛋白的磷酸化及脱磷酸化与足细胞损伤及蛋白尿联系起来后发现，Nephrin蛋白在生理学上对足细胞的分子结构及功能有着重要作用。这些可说明Nephrin在肾脏蛋白尿疾病的病理学进展中发挥重要作用，被作为肾脏蛋白尿疾病早期足细胞损伤的重要标志物之一。本实验研究发现，DN组肾组织Nephrin mRNA及蛋白表达较NC组减少，OM组用奥美沙坦酯干预后肾组织Nephrin mRNA及蛋白表达增加。这提示DN大鼠出现了足细胞损伤，而奥美沙坦酯对DN足细胞损伤有一定修复作用。

在以往的研究报道中，Jia等[9]给予SD大鼠AngⅡ喂养14 d后可出现高血压和蛋白尿，足细胞裂孔隔膜变窄以及Nephrin mRNA和蛋白表达增加，喂养28 d后可明显发现足细胞凋亡及Nephrin mRNA和蛋白表达减少，并且足细胞凋亡数与Nephrin表达呈负相关。有学者进一步进行动物实验和细胞实验后发现，AngⅡ导致Nephrin脱磷酸化及足细胞凋亡与Caveolin-1磷酸化相关，并且推测Ang Ⅱ-Caveolin-1-Nephrin信号通路可为肾素-血管紧张素系统相关足细胞损伤疾病的治疗提供新靶点[10]。动物实验研究显示，奥美沙坦酯对DN蛋白尿的改善作用可能与其对足细胞的保护作用有关[4,5]。这些研究结果均提示，AngⅡ的增多可能导致足细胞损伤。本实验中OM组给予ARBs奥美沙坦酯干预后，DN大鼠足细胞损伤改善，尿蛋白排泄、Scr、BUN降低。我们推测，奥美沙坦酯的肾脏保护作用与其阻断AngⅡ信号传导，导致Nephrin表达上调有关。

通过对牛视网膜血管内皮细胞的体外研究发现，AngⅡ可促进VEGF的释放。Kang等[11]研究发现，在足细胞中加入AngⅡ后，VEGF蛋白及mRNA的表达增加与AngⅡ存在剂量依赖性关系，在给予氯沙坦后AngⅡ诱导的VEGF蛋白及mRNA的表达增加被抑制。动物实验显示，DN大鼠肾脏组织中VEGF表达明显升高、尿蛋白增多，给予AngⅡ受体阻滞剂L158809干预后大鼠VEGF表达下调、尿蛋白减少。本实验中，DN大鼠VEGF mRNA和蛋白表达增多，给予奥美沙坦酯干预后VEGF mRNA和蛋白表达减少，与上述文献报道一致。

VEGF与DN足细胞损伤、蛋白尿出现关系密切。有研究发现，VEGF-A的基因多态性与糖尿病视网膜病变及DN有关[12,13]。人体肾脏组织活检发现，在DN早期VEGF mRNA表达增多[14]；同样，在啮齿类DN动物模型中也发现VEGF表达增多[15]。体内实验发现，VEGF亚型VEGF165可诱导足细胞Nephrin及VEGFR2酪氨酸磷酸化，导致足细胞足突融合[16]。有学者在阿霉素诱导的大鼠肾脏蛋白尿疾病模型中发现，VEGF表达较正常大鼠明显升高，同时Nephrin表达下降。上述研究均提示VEGF与足细胞损伤关系密切，可调控Nephrin的表达。本实验中奥美沙坦酯干预后DN大鼠VEGF表达减少，Nephrin表达上调，尿蛋白排泄减少。由此我们推测，奥美沙坦酯可阻断AngⅡ信号传导，进而下调VEGF表达、上调Nephrin表达，从而减少大鼠尿蛋白的排泄，对肾脏有一定保护作用。