miR-194对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖、凋亡的影响及其机制

王纯斌，袁琳，王梅娟，沈福军，黎超，赵明宏

(1东南大学医学院附属盐城医院，江苏盐城 224001；2盐城市第三人民医院；3南通大学附属建湖医院；4建湖县人民医院)

肺癌是最常见的恶性肿瘤，位居全球癌症相关死亡原因的第一位[1]。肺癌根据病理组织类型和临床特征可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC占80%左右[2]。目前，虽然许多分子靶点已经明确可以改善NSCLC的治疗疗效，但患者5年总生存率仍为16%[3]。NSCLC靶向药物耐药、转移及进展的主要原因是肺癌分子改变的异质性[4]，因此进一步寻找肺癌发生发展新的分子机制，对提高NSCLC患者的治疗及改善生存质量具有重要意义。微小RNA(microRNA)是一类非编码单链小分子RNA，长度19～25个核苷酸，其通过与靶基因mRNA的3′非翻译区结合调控基因转录后表达水平[5]，在癌症细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物过程中起关键作用[6]。研究[7]显示，miRNA在NSCLC中表达异常，并可作为癌症生物标志物和药物靶点。文献[8,9]报道，miR-194在肺癌组织中低表达与患者生存期短显著相关，且低表达的miR-194通过靶向hNUDC促进NSCLC细胞95C和95D的增殖参与肺癌的发生，但miR-194在NSCLC细胞中的凋亡作用及机制目前研究涉及较少。2017年1月～2018年6月，本研究观察了miR-194对人NSCLC细胞系A549增殖、克隆形成、凋亡能力的影响，并探讨其可能机制，旨在为开发NSCLC基因治疗新靶标提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 细胞、miR-194抑制物、miR-194模拟物及主要试剂 A549细胞、人肺正常上皮细胞16HBE均购自美国ATCC细胞库；miR-194抑制物、miR-194 mimics、内参GAPDH的引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成；RPMI1640培养基、DMEM-F12培养基、FBS购自美国Gibco公司，MTS细胞增殖检测、细胞凋亡检测试剂盒、蛋白裂解试剂购自南京凯基生物技术有限公司，逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒均购自日本TaKaRa公司，脂质体2000、TRIzol均购自美国Invitrogen公司，兔抗人JAK2(ab108596)、pSTAT3(ab76315)、兔抗人活化的Caspase-3抗体(ab2302)、鼠抗人GAPDH抗体(ab8245)、BCA试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 A549、16HBE细胞中miR-194检测 将A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，16HBE细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1460培养基中，放置37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，Nanodrop 2000鉴定总RNA符合实验要求，将RNA逆转录成cDNA作为模板进行荧光定量PCR，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40个循环。miR-194引物序列：5′-CATT-CAACGCTGTCGGTGAGT-3′，5′-GCTGTCAACGATACGC-TACGTAACG-3′，GAPDH引物序列：5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′，5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′。以GAPDH作为内参基因，以2-ΔΔCt代表目的基因的相对表达量。

1.3 miR-194抑制物、模拟物转染及细胞分组 A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，放置37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染前24 h，将呈对数生长且生长情况良好的细胞接种于6孔细胞板，细胞融合度达80%时按照试剂说明书，采用脂质体2000将miR-194抑制物、miR-194模拟物、对照分别转染至细胞中(分别计为A、B、C组)。转染后继续培养48 h，后收集细胞进行后续实验。

1.4 转染后的A549细胞miR-194检测方法 取转染48 h后的各组细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，Nanodrop 2000鉴定总RNA符合实验要求，将RNA逆转录成cDNA作为模板进行荧光定量PCR，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40个循环。miR-194引物序列：5′-CATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3′，5′-GCTGTCAACGATACGCTAC GTAACG-3′，GAPDH引物序列：5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA -3′，5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′。以GAPDH作为内参基因，应用2-ΔΔCt法计算miR-194相对表达水平。

1.5 转染后的A549细胞增殖能力检测 取转染48 h后的各组细胞，以每孔2 000个细胞、150 μL培养基接种于96孔板中，每组设6个平行复孔，放至培养箱中培养，分别在铺板后第0、24、48、72 h各孔加入30 μL的MTS工作液，培养箱中孵育2 h后，扫描酶标仪490 nm波长处测取OD值，OD值越高提示存活细胞数越多，细胞相对增殖能力越强。实验重复3次，取平均值。

1.6 转染后的A549细胞克隆形成能力检测 取转染48 h后的各组细胞，以每孔300个细胞、2 mL培养基接种于6孔板中，每组设3个平行复孔，放至培养箱中培养，培养1周时，各组转染试剂重复加入各组孔中1次，继续培养1周，肉眼观察到克隆团时，弃掉培养基，PBS洗3次，1 mL甲醇固定15 min，晾干后加入1 mL苏木素染色30 min，双蒸水冲洗后晾干，扫描拍照，计数肉眼可见克隆数。实验重复3次，取平均值。

1.7 转染后的A549细胞凋亡能力检测 ①Hoechst 33342染色：取转染48 h及1 mmol的H2O2处理12 h后的各组细胞，以每孔1×106个细胞、2 mL培养基接种于6孔板中，每组设3个平行复孔，放至培养箱中培养24 h，弃掉培养基，PBS小心洗3次，1 mL的4%多聚甲醛固定30 min。PBS小心洗3次，用Hoechst 33342染色液室温下避光孵育30 min，PBS小心洗3次。封片后倒置荧光显微镜观察蓝色的细胞核形态。②流式细胞仪：用无EDTA的胰酶收集转染48 h及1 mmol的H2O2处理12 h后的各组细胞，每管1×106个细胞，PBS洗3次后，加入500 μL的染色工作液(500 μL Binding Buffer，5 μL Annexin V-APC，5 μL 7-ADD染液)，混匀后避光室温孵育15 min。PBS洗1次后，流式细胞仪检测凋亡细胞百分数。实验重复3次，取平均值。

1.8 转染后的A549细胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白检测 收集转染48 h及1 mmol的H2O2处理12 h后的各组细胞，每孔加入500 μL的蛋白裂解液(含有5 μL的蛋白酶抑制剂和5 μL的磷酸酶抑制剂)，超声裂解30 min，在4 ℃条件下以12 000 r/min离心30 min，将上清转移至新的EP管中，BCA试剂盒测蛋白浓度，煮沸变性后，每孔50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，经湿转将蛋白转移至PVDF膜，8%脱脂牛奶封闭3 h，加入GAPDH和JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，二抗孵育室温孵育2 h，ELC化学发光法曝光条带，扫描拍照。蛋白条带灰度值采用Quantity One V4软件进行分析。结果重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 A549、16HBE细胞中miR-194相对表达量比较 A549、16HBE细胞中miR-194相对表达量分别为1.00±0.10、8.17±0.14，两者比较，P<0.05。

2.2 各组细胞miR-194相对表达量比较 A、B、C组miR-194相对表达量分别为0.31±0.11、8.35±0.31、1.00±0.10，A、B组分别与C组比较，P均<0.05。

2.3 各组细胞增殖能力比较 各组细胞不同时点OD值比较见表1。

表1 各组细胞不同时点OD值比较

注：与C组比较，*P<0.05。

2.4 各组细胞克隆能力比较 A、B、C组细胞克隆数目分别为(232.12±10.82)、(43.67±10.97)、(127.33±6.43)个，A、B组分别与C组比较，P均<0.05。

2.5 各组细胞凋亡能力比较 ①Hoechst 33342染色结果：与C组比较，A组细胞凋亡现象及数目明显减少，B组细胞凋亡现象及数目明显增多。②流式细胞仪检测结果：A、B、C组细胞凋亡率分别为4.58%±1.01%、21.45%±1.78%、10.23%±1.65%，A、B组分别与C组比较，P均<0.05。

2.6 各组细胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白相对表达量比较 结果见表2。

表2 各组细胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与C组比较，*P<0.05。

3 讨论

NSCLC是最常见的恶性程度较高的肿瘤，严重威胁人们的生命健康[10]。目前，NSCLC的治疗手段包括手术、放化疗、分子靶向和生物治疗，随着医学技术的进步，治疗虽然有一定的疗效，但发病率和病死率仍居高不下[11,12]。NSCLC的发病机制至今尚未阐明，研究在NSCLC发病过程中起作用的关键因子，可能为治疗提供新的靶标，以降低患者病死率和改善患者预后。A549细胞源自一名58岁的白人男性，是1972年由GiardDJ通过肺癌组织移植培养建系的，被研究者广泛应用。

越来越多的miRNAs在肿瘤中表达失调及发挥的作用逐步被挖掘[13]，miRNAs是一类高度保守的小分子单链RNA，其不能编码蛋白质，但可以通过调控基因的转录影响蛋白的表达，同时还可以调控多条肿瘤发生发展密切相关信号通路[14,15]，因此miRNAs在肿瘤的发生和恶性进展中具有重要作用。此外，在肿瘤中表达失调的miRNAs具有癌基因和抑癌基因的功能，可以作为治疗肿瘤的药物靶点[16]。最近在多种肿瘤中发现miR-194表达失调，其在胃肠消化系统中特异性表达。miR-194是首先通过抑制肝癌细胞的转移而被鉴定为小鼠肝上皮细胞中的抑制基因[17]，同样在卵巢癌和黑色素瘤中检测到miR-194低表达[18,19]，miR-194通过靶向KDM5B抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭，诱导凋亡[20]。研究[8]表明，miR-194在NSCLC中下调，并且表达水平降低与患者预后差密切相关，但miR-194的低表达与NSCLC凋亡的关系尚不清楚。本研究显示，miR-194在A549细胞中表达低于16HBE细胞，与已有的研究一致；A549细胞转染miR-194抑制物后miR-194表达降低，细胞增殖能力和平板克隆形成能力升高，H2O2诱导的细胞凋亡减少；A549细胞转染miR-194 mimics后miR-194表达升高，细胞增殖能力和平板克隆形成能力降低，H2O2诱导的细胞凋亡增多。

细胞凋亡是生命活动的正常现象，细胞功能受损及衰老时凋亡程序启动，以维持机体内稳态，细胞凋亡程序的启动是一个严格有序的过程，Caspase蛋白的改变是细胞凋亡发生的重要标志，而Caspase-3是以无活性的前体存在，在细胞接受到一系列的凋亡信号后Caspase-3经过剪切成为活化的执行因子Caspase-3，其是细胞凋亡不可逆的标志[21]。本研究显示，A组活化Caspase-3蛋白表达减少，B组表达增多，提示细胞中miR-194可以作用于凋亡蛋白Caspase-3促进细胞凋亡。而细胞凋亡受一系列基因的共同调控，JAK/STAT3信号通路是近年发现的一条参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程的信号转导通路[22,23]。JAK/STAT3信号通路在正常生命活动中受到严密的调控，JAK激活后使受体上的酪氨酸残基发生磷酸化而结合STAT3，引起STAT3的过度活化，其由失活状态转为磷酸化状态(pSTAT3)，pSTAT3作为一个重要的转录因子进入细胞核内，通过特异性结合DNA调节抗凋亡靶基因转录发挥抗凋亡功能[24]。本研究发现，A组JAK2、pSTAT3蛋白表达降低，B组升高；李雷雷等[25]利用JAK2/STAT3特异性阻断剂AG490阻断JAK2/STAT3通路，发现活化Caspase-3蛋白表达增多。由此我们确定，miR-194抑制NSCLC细胞的JAK2/STAT3信号通路以促进NSCLC细胞凋亡。

总之，miR-194通过抑制JAK2/STAT3信号通路作用于Caspase-3蛋白诱导NSCLC细胞的凋亡，是细胞诱导凋亡的潜在靶点，可以为干预和防治NSCLC提供新的思路。