荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性

王嘉禹，赵美萍

(北京分子科学国家研究中心，生物有机与分子工程教育部重点实验室，北京大学化学与分子工程学院，北京 100871)

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)，又称氧化还原因子-1(redox effector factor-1，Ref-1)，是人体内的一种重要的DNA修复蛋白与基因调控蛋白。一方面，它作用于DNA双链中的脱嘌呤/脱嘧啶位点(apurinic/apyrimidinic sites，简称脱碱基位点)，是人体内最为重要的脱碱基核酸修复酶，在碱基切除修复途径(base excision repair，BER)中发挥重要作用；另一方面，APE1还能通过其氧化还原功能调控多种转录因子的DNA结合活性[1-2]。已有研究表明，人体血液及组织细胞中APE1含量的异常变化与多种疾病相关，血清中APE1可作为生物标志物辅助肺癌、前列腺癌等疾病的临床诊断。此外，细胞内APE1的含量也会受活性氧等物质的影响。细胞暴露实验表明，大气中的颗粒物会提高细胞中APE1 mRNA的表达水平[3]，但由于细胞中的mRNA表达水平并不与对应蛋白的表达水平完全相关，若要说明细胞受到的氧化性损伤程度与APE1表达水平的关系，需要对细胞内的APE1含量进行直接定量。另外，有研究表明APE1水平还与抗药性相关，抑制APE1活性有助于提高细胞对药物的敏感性[4]。因此，开发一种简单而灵敏的检测生物样品中APE1活性的方法对于癌症的诊断、预后监测以及抗癌药物筛选而言均具有重要的作用。

现有的APE1检测方法主要有电化学分析法[5]、凝胶电泳法[6]、酶联免疫吸附分析法[7]、液质联用技术[8-9]与荧光探针法[10]等。其中，荧光探针检测法相比于其他方法具有操作简便、灵敏度高等优点，能实现生物样品中APE1含量的高通量检测。本课题组Fang等[10]开发的APE1荧光探针对APE1具有良好的选择性，不受生物样品中其他核酸酶的干扰。但在检测APE1含量非常低的血清样品时，该方法的灵敏度不足(最低检测限0.1 U/mL)，影响了定量的可靠性。在该方法基础上，本研究改进了检测反应的条件，显著提高了方法的灵敏度。新方法适用于不同来源、含量分布范围宽的人血清样品中APE1含量的定量检测。此外，本研究还进一步建立了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)蛋白提取液中APE1含量的测定方法，并对实际样品进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 PBMCs的提取

以EDTA抗凝采血管采集全血样品(0.5～1.5 mL)，加入等体积0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS，pH=7.4)稀释后，用巴氏吸管吸取并小心加到人外周血淋巴细胞分离液中。室温下，将混合溶液在水平转子中离心，可看到有明显的分层。用巴氏吸管小心吸取第一层与第三层之间的白膜细胞层至新离心管，并用0.01 mol/L PBS溶液洗涤得到的细胞。随后将得到的细胞重悬于红细胞裂解液(155 mmol/L氯化铵、10 mmol/L碳酸氢钾、0.1 mmol/L EDTA)，至细胞团由粉红色变为白色。离心除去上层溶液，用0.01 mol/L PBS溶液洗涤细胞两次，可得PBMCs。

1.3 PBMCs蛋白质提取

将PBMCs重悬于0.01 mol/L PBS溶液中，加入适量蛋白酶抑制剂复合物后在4 ℃孵育30 min，随后将细胞悬液放在-75 ℃下冻存。将冻存的细胞在30 ℃水浴中解冻后，加入220 mmol/L氯化钾，再在4 ℃孵育30 min，随后在4 ℃下以13 000 r/min转速离心15 min除去细胞碎片，得到的上层溶液即为PBMCs蛋白质提取液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白提取液中蛋白质的总浓度。

1.4 蛋白提取液及血清中APE1活性的测定

用0.04%(体积分数)Triton X-100 将APE1标准溶液(10 000 U/mL)稀释至不同浓度。将APE1探针加入到组成为0.04% Triton X-100、50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-Ac、10 mmol/L Mg(Ac)2、1 mmol/L 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)的反应缓冲液中，升温退火后加入待测样品(蛋白提取液或血清)或稀释至不同浓度的APE1标准溶液，立即在37 ℃下对溶液进行实时荧光检测。反应液荧光强度随时间变化曲线的斜率即为荧光强度上升速率，通过测定APE1标准溶液得到的标准曲线计算出原蛋白提取液中或血清中APE1的活性。检测反应均在200 μL PCR管中进行，反应溶液总体积为50 μL，APE1探针终浓度为300 nmol/L，APE1标准溶液和待测样品的加入体积为2～5 μL。实时荧光由Rotor-Gene Q实时荧光PCR仪进行检测，荧光基团ROX的激发波长与发射波长分别为585 nm和610 nm，测定荧光的仪器通道为Orange通道，Gain值为10。

2 结果

2.1 检测反应液的优化以及方法的灵敏度和线性范围

目前最常用的两种APE1反应缓冲液分别是NEB缓冲液1.1(10 mmol/L Bis-Tris propane-HCl、10 mmol/L MgCl2、100 μg/mL牛血清蛋白)和NEB缓冲液4[50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-Ac、10 mmol/L Mg(Ac)2、1 mmol/L DTT]。实验发现在两种缓冲液中，APE1荧光探针对APE1的响应差别很大。在不额外加入其他辅助试剂的情况下，探针在NEB缓冲液1.1中对酶响应的灵敏度和稳定性都优于在NEB缓冲液4中。我们曾选择以NEB缓冲液1.1作为基础，在其中额外加入3.5 mg/mL人血清蛋白，进一步改善了方法的灵敏度和抗干扰能力，可在实际血清样品背景中定量测定APE1的活性[10]。但临床样品中APE1的浓度分布范围很宽，有些接受过治疗的患者血清中APE1的浓度会明显下降，接近现有方法的最低检测限(0.1 U/mL)，导致定量结果不可靠。

本研究尝试以NEB缓冲液4作为基础，探索进一步提高检测灵敏度的反应条件。通过多种对照实验后发现，在NEB缓冲液4中额外加入0.04% Triton X-100，可使荧光信号显著上升。由图1A可见，在新反应液中探针对APE1响应的灵敏度甚至大大超过了之前在NEB缓冲液1.1加上3.5 mg/mL人血清白蛋白中反应的方法。且在新的反应液中，酶的稳定性也进一步提高，对于准确测定样品中酶的活性十分有利。我们推测表面活性剂Triton X-100的加入不仅减少了操作过程中管壁对酶和探针可能存在的非特异性吸附作用，而且表面活性剂分子有可能结合到APE1分子的某些疏水性区域，导致酶的构像发生变化，活性增强。另外，溶液中胶束的形成还有可能为APE1酶与DNA底物之间的反应提供适宜的界面，从而使反应速率显著加快，具体机制目前还在进一步研究中。

图1B和图1C显示了在新反应液中不同浓度APE1与探针反应的实时荧光曲线。图1D为标准曲线，方法的线性范围为0.01～2.0 U/mL，对APE1的检测限降低到0.005 U/mL(3 pg/mL)，灵敏度比之前的方法提高了近20倍[10]。测得高浓度样品的日间变异系数为1%，中等浓度样品的日间变异系数为5%，所测最低浓度样品(0.005 U/mL)的日间变异系数为8%(n=10)。因此，方法的功能灵敏度也为0.005 U/mL(3 pg/mL)。

图1 A，在不同反应缓冲液中APE1探针(200 nmol/L)对相同浓度APE1(2.0 U/mL)响应的荧光曲线，其中NEB缓冲液4+0.04%Triton X-100为本研究新开发的反应缓冲液；B，在新反应液中APE1探针(300 nmol/L)与0.01～2.0 U/mL 范围内不同浓度APE1反应的荧光曲线；C，在新反应液中APE1探针(300 nmol/L)与0.005～0.1 U/mL范围内不同浓度APE1反应的荧光曲线；D，在新反应液中检测APE1的线性范围Figure 1 A, Fluorescence responses of the APE1 probe (200 nmol/L) to APE1 (2.0 U/mL) in different reaction buffers. NEB buffer 4+0.04% Triton X-100 is the new reaction buffer developed in this work; B, Fluorescence responses of the APE1 probe (300 nmol/L) to APE1 at different concentrations in the range from 0.01 to 2.0 U/mL in the new reaction buffer; C, Fluorescence responses of the APE1 probe (300 nmol/L) to APE1 at different concentrations in the range from 0.005 to 0.1 U/mL in the new reaction buffer; D, Linear working range of the APE1 probe in the new reaction buffer

2.2 人PBMCs蛋白质提取液中APE1活性的检测

在全血样品稀释液中加入人外周血淋巴细胞分离液后，通过密度梯度离心法分离了8份全血样品中的PBMCs(图2A)。按照前文所述步骤，用冻融法提取PBMCs中的蛋白质，用APE1荧光探针测定了PBMCs蛋白质提取液中APE1的含量，并用BCA蛋白定量试剂盒测定了8份蛋白提取液中的蛋白质含量。根据蛋白提取液中的总蛋白质浓度与APE1活性，所测8份PBMCs样品中APE1的含量为0.11～0.72 U/μg 蛋白(0.061～0.40 ng/μg蛋白)，平均含量为0.30 U APE1/μg 蛋白(0.16 ng APE1/μg蛋白)。通过加标回收实验测得在PBMCs蛋白提取液中APE1的加标回收率为98%±5%(n=3)。

2.3 人血清中APE1活性的检测

血清中含有大量蛋白质、多肽、脂质等组分，血清背景对其中微量蛋白的定量测定常带来严重干扰[11-12]。由于荧光探针灵敏度高，将血清样品稀释后进行测定，不仅可以减少血清需求量，而且有助于减小血清背景的干扰。为了确保稀释后的血清中APE1的含量与原始样品中APE1的含量有较好的线性相关性，我们选择在探针反应液中加入血清的量分别为5.0 μL、3.5 μL和2.0 μL，对应血清稀释倍数分别为10倍、14倍和25倍。将检测结果换算回原始血清中APE1的含量，由图2B可以看到，三种不同稀释倍数下得到的结果基本一致，相差在5%以内。由于将血清稀释25倍后，部分血清的APE1活性会接近检测限，不利于定量的准确性，因此在实际测量过程中选择将血清稀释14倍进行检测，这样一方面保证了稀释后的血清中APE1活性在方法的线性范围之内，另一方面也能相对减少血清的需求量。采用以上条件对102份正常人(男51例、女51例，年龄59～75岁)血清样品中的APE1含量进行了检测，得到这些血清样品中APE1含量的分布范围为0.13～0.34 ng/mL，加标回收率为96%±15%(n=3)。

PBMC, peripheral blood mononuclear cells.图2 A，密度梯度离心法分离人PBMCs；B，不同稀释倍数测得原始血清中APE1的含量对照Figure 2 A, Isolation of PBMCs by density gradient centrifugation; B, Comparison of the APE1 concentration in human serum determined by different dilution folds

3 讨论

APE1是人体中一种重要的多功能蛋白。首先，APE1在人体细胞中行使着超过95%的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶活性，在碱基切除修复途径中起着不可替代的作用[13]；其次，APE1作为氧化还原因子，对多种转录因子有重要的调控作用，影响多种基因的表达[14]；再次，APE1还能识别并切除多种DNA碱基损伤，在RNA代谢及miRNA的调控中扮演着重要的作用[2,15]。

有研究表明，APE1在多种癌细胞中出现表达异常的情况，包括定位和蛋白表达水平的变化[14]。例如在前列腺癌[16]和肺癌[17]等癌细胞中，APE1的表达水平与正常细胞相比有明显的提高,而在卵巢上皮癌[18]等癌细胞中，APE1的分布与正常细胞相比有所不同。另外，血清中APE1的含量也会随癌症等疾病的发生和发展而变化，如非小细胞肺癌[7]和膀胱癌[19]等。因此，对生物样品进行APE1含量的测定对于癌症的诊断与治疗效果的监控等都具有非常重要的意义。

传统的核酸酶检测方法，如电化学分析法、凝胶电泳法等，往往需要较为繁琐的操作步骤，检测用时长，难以对生物样品进行直接、快速的检测。免疫分析法，如酶联免疫吸附分析法等，利用了抗原与抗体的特异性结合作用实现对核酸酶的检测，有着较高的灵敏度，但由于血清中APE1自身抗体的存在[20]，在检测过程中会干扰APE1与外加标记抗体间的结合，影响了结果的准确性。近些年来，随着液质联用技术的发展，已经出现了利用液相色谱-质谱联用技术测定生物样品中APE1的方法[8-9]，但液质联用技术需要非常复杂的样品前处理过程，且现有的技术灵敏度仍不够高，需要较大的样品量，不利于大规模推广到临床检测应用。

与上述方法相比，荧光探针法具有操作简便、耗时短、灵敏度高、样品用量少等优点。但是在检测低浓度样品时，目标蛋白的稳定性及在反应管壁的非特异性吸附等都会给检测结果带来显著的影响，这就要求进一步提高检测方法的灵敏度和检测过程中低浓度蛋白的稳定性。在我们之前发展的荧光探针法的基础上[10]，本研究进一步改进了反应缓冲液的组成，显著提高了APE1荧光探针对目标酶响应的灵敏度。改进后的荧光分析法最低检测限达到3 pg/mL，比ELISA法(0.02 ng/mL[7])更为灵敏，且样品消耗量更少，即使在检测APE1含量较少的血清样品时，也只需要约3.5 μL的血清样品。此外，本文方法在检测APE1时只需一步操作，相比于ELISA法耗时更短，利于实现大量生物样品的检测。与之前在反应体系中加入高浓度人血清蛋白(3.5 mg/mL)的方法相比，本文的方法成本更低、稳定性更好、使用也更加方便，在临床检验和实验室研究中都具有良好的应用前景。