响应面法优化银鳕鱼脱腥工艺

张淼，杨凯，张佳敏，胡乐，黄羽，范文教

（1.四川旅游学院食品学院，四川 成都 610100；2.肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106）

银鳕鱼又叫裸盖鱼，是高蛋白低脂肪的深海鱼代表[1]，肉质细嫩鲜美，体内含有丰富的不饱和脂肪酸，尤其适合婴幼儿、妇女及老人的食用，不少国家把银鳕鱼作为主要食用鱼类原料。但由于银鳕鱼体内的腥味物质特征成分三甲胺含量较高，制约了银鳕鱼产品的加工，影响了银鳕鱼产品的品质。鳕鱼体内的腥味物质的主要来源是由于其自身具有的挥发性有机化学物醛、酮以及甲胺类物质，其中以三甲胺含量作为腥味物质的主要来源[2-4]。

目前国内对于鱼类脱腥方式的研究较多，常用化学脱腥剂、物理脱腥剂、生物脱腥剂、天然脱腥剂以及复合脱腥剂对鱼肉进行脱腥处理[5]，以减少鱼肉中含有的腥味物质，使得鱼肉本身的风味能够得到更好的发挥，增加产品的多样化，扩大鱼肉的食用范围。但目前针对鳕鱼脱腥并未进行详细的研究，并且多为单一脱腥剂对鳕鱼进行脱腥处理，在脱腥的效果上没有取得显著的效果。马丽杰等[6]将鳕鱼皮洗干净，搅碎后利用微生物发酵技术制备鱼皮胶原蛋白多肽，并且利用微生物发酵脱去鱼皮的腥味，黄薇等[7]以鳕鱼皮复合酶解液采用粉末状活性炭、酵母粉和β-环糊精为脱腥脱苦材料并通过正交试验设计研究了复合酶解液的脱腥脱苦工艺技术条件。

相关研究表明，茶叶中含有茶多酚、黄酮类化合物、萜烯类化合物以及儿茶素类化合物等，黄酮类与萜烯类化合物能够吸附异味，而儿茶素类化合物可以与氨基酸结合从而具有一定的钝化酶类和杀菌作用，还可以消除甲硫醇化合物，作为天然抗氧化剂的茶多酚也可以除臭和吸附异味[8]。氯化钙可以通过晶体渗透作用和盐析来除去腥味，此外，氯化钙可以增加原料中Ca2+的含量，从而改善原料中的钙素营养，预防由于缺钙而引发的佝偻病等缺钙症状[9]。

本试验选择CaCl2和绿茶进行复配，作为复合脱腥剂，对脱腥的工艺条件进行优化，从而降低银鳕鱼中的腥味物质，并且不对银鳕鱼肉的营养成分带来损失。在去除银鳕鱼中的腥味物质的同时增强了银鳕鱼肉的风味及营养，本研究拟为以后的鱼类脱腥工艺研究奠定一定的理论基础及技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

银鳕鱼：永辉超市成都市龙泉驿区皇冠国际店；绿茶：紫芸秀芽，重庆市渝川茶业有限公司巴南分公司茶叶加工厂。

1.1.2 主要试剂

三氯乙酸、氯化钙：上海展云化工有限公司；浓硫酸：永飞化工厂；甲苯：莱阳经济技术开发区精细化工厂；苦味酸：台山市众城化工有限公司；碳酸钾、甲醛：南京维之诚化学试剂有限公司；碳酸镁：南京化学试剂股份有限公司；三甲胺盐酸盐：上海展云化工有限公司；无水硫酸钠：天津市化学试剂厂。以上化学试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器设备

紫外可见分光光度计（UV-1800）：上海美谱达仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-12）、电热鼓风干燥箱（DHG-9015A）：上海一恒科技有限公司；电子天平（JJ523BC）：常熟市双杰测试仪器厂；自动凯氏定氮仪（KDN-AZ）：上海精科仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

市售银鳕鱼解冻，经去骨、去皮后，取肉，切成2 cm×2 cm×2 cm 的鱼块备用。

1.2.2 单因素试验设计

1）不同浓度复合脱腥剂对脱腥效果的影响

取鱼肉5 份，配置绿茶与氯化钙质量比为1 ∶1 的复合脱腥剂，浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%，原料与脱腥料液比为 1 ∶15（g/mL），于 35 ℃恒温水浴锅中，浸泡30 min。研究复合脱腥剂浓度对三甲胺含量及感官得分的影响。

2）脱腥剂浸泡料液比对脱腥效果的影响

取鱼肉5 份，配置绿茶与氯化钙质量比为1 ∶1 的复合脱腥剂，复合脱腥剂浓度为3%，原料与脱腥剂料液比分别为 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），于35 ℃恒温水浴锅中，浸泡30 min。研究浸泡料液比对三甲胺含量及感官得分的影响。

3）浸泡温度对脱腥效果的影响

取鱼肉5 份，配置绿茶与氯化钙质量比为1 ∶1 的复合脱腥剂，复合脱腥剂浓度为3%，原料与脱腥剂比为 1 ∶10（质量比），分别放入 25、30、35、40、45 ℃的恒温水浴锅中，浸泡30 min。研究浸泡温度对三甲胺含量及感官得分的影响。

4）浸泡时间对脱腥效果的影响

取鱼肉5 份，配置绿茶与氯化钙质量比为1 ∶1 的复合脱腥剂，复合脱腥剂浓度为3%，原料与脱腥剂比为 1 ∶10（g/mL），在温度为 40 ℃的恒温水浴锅中，分别浸泡 10、20、30、40、50 min。研究浸泡时间对三甲胺含量及感官得分的影响。

1.2.3 响应面法优化试验设计

在单因素试验确定最优参数范围的基础上，以复合脱腥剂浓度、浸泡料液比，浸泡时间、浸泡温度作为自变量，以三甲胺含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理设计四因素三水平的响应面分析试验[10-11]。试验因素及水平见表1。

表1 工艺参数优化试验设计方案Table 1 Design of optimization for process parameters

1.2.4 测定指标

1.2.4.1 感官评分标准

对银鳕鱼肉进行脱腥处理后，利用高温熟制，待鱼肉冷却至室温（25 ℃），采用3 位随机编码编号，让评定人员根据编号顺序通过感官进行评分。感官评分采用100 分制，腥味为主要成分占60%，色泽与口感为次要因素各占20%，最终评分由多次打分后的平均值得到，最终结果以整数为准。感官指标评分标准见表2。

表2 银鳕鱼感官指标评分标准Table 2 Sensory index score criteria of cod

1.2.4.2 三甲胺（trimethylamine，TMA）的测定

使用分光光度法，根据国标GB 5009.179-2016《食品安全国家标食品中三甲胺的测定》[12]测定鱼肉的三甲胺含量。

1）标准曲线的绘制

准确的吸取 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mL 三甲胺标准溶液（等同于 0、2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL的三甲胺氮）放入25 mL 比色管中，不足5 mL 的标准溶液加入蒸馏水补至5 mL，以蒸馏水当空白试验做参照，按照试样操作方法进行测定，做浓度-吸光度回归曲线。三甲胺含量标准曲线见图1。

图1 三甲胺含量标准曲线Fig.1 Standard curve of trimethylamine

2）试样的测定

将鱼肉利用搅拌机搅碎，取10.000 g 放入带塞三角烧瓶中，再加入20%的三氯乙酸10 mL 和70 mL 蒸馏水，充分摇匀，静置30 min，直到沉淀完成之后进行过滤，取5 mL 的滤液放入25 mL 比色管中，然后再依次加入10%的甲醛溶液1 mL，无水甲苯10 mL 以及饱和碳酸钾溶液3 mL，塞上瓶盖，进行剧烈摇晃约70次，静置30 min，在比色管中加入0.5 g～1 g 无水硫酸钠，然后吸取6 mL～9 mL 甲苯萃取液加入比色管中塞上管塞脱水约5 min，吸取清液5 mL 置于预先制备的5 mL 0.02%的苦味酸甲苯溶液的比色管中进行显色，利用空白试验作为参比，采用1 cm 的比色皿于410 nm波长处进行吸光度的测定，根据所测数据制定的标准曲线，按照下列公式计算试样中三甲胺含量[9]。

式中：TMA 为试样中三甲胺-氮含量，mg/kg；C 为试样中三甲胺-氮浓度，μg/mL；V 为试样处理总体积，mL；m 表示称取试样质量，g。

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 复合脱腥剂浓度对去腥效果的影响分析

复合脱腥剂浓度对三甲胺含量和感官评定值的影响见图2 和图3。

由图2 可以看出，三甲胺的含量随着复合脱腥剂浓度的增加而逐渐降低，当复合脱腥剂的浓度超过3%时，三甲胺的含量开始趋于稳定，并呈现上升的趋势。分析原因，随着浓度的增加，复合脱腥剂的脱腥能力逐渐增强，当浓度到达3%时，复合脱腥剂的脱腥能力到达其极限水平。由图3 可以看出，随着复合脱腥剂浓度的增加，银鳕鱼的感官值逐渐增加，当复合脱腥剂浓度超过3%时，又开始对鱼肉感官造成影响。分析原因主要是由于在感官评定指标中涉及到色泽与口感，当浓度到达4%之后，银鳕鱼经浸泡之后，由于茶叶中色素的影响，肉质表面呈现一抹绿色，吃到口中时，鱼肉中也呈现出有茶的味道，从而覆盖了部分鱼肉自身鲜美的味道。因此选择复合脱腥剂浓度为3%进行下一步试验。

图2 复合脱腥剂浓度对三甲胺含量的影响Fig.2 Effects of compound dexing agent concentration on the content of trimethylamine

图3 复合脱腥剂度对感官评定值的影响Fig.3 Effects of compound dexing agent concentration on sensory evaluation

2.1.2 复合脱腥剂不同浸泡料液比对去腥效果的影响

复合脱腥剂不同浸泡料液比对三甲胺含量和感官评定值的影响见图4 和图5。

图4 浸泡料液比对三甲胺含量的影响Fig.4 Influence of soaking liquid ratio on the content of trimethylamine

图5 浸泡料液比对感官评定值的影响Fig.5 Effects of soaking liquid on sensory evaluation values

由图4 和图5 可以看出，随着浸泡溶剂体积的增加，三甲胺的含量先降低后增加，然后趋于稳定，当料液比在1 ∶10（g/mL）时，三甲胺的含量最低。感官评定值随着溶剂体积的增加，呈现先增加后降低的趋势，当料液比为 1 ∶10（g/mL）时，感官评定最佳。经分析，在料液比为1 ∶10（g/mL）脱腥剂中，对银鳕鱼的感官影响程度低，当溶剂体积增加时，随着脱腥剂浓度的增加，影响到了银鳕鱼的色泽与口感，从而其感官评定逐渐降低。因此，选择料液比为1 ∶10（g/mL）进行下一步试验。

2.1.3 复合脱腥剂不同浸泡温度对去腥效果的影响

复合脱腥剂不同浸泡温度对三甲胺含量和感官评定值的影响见图6 和图7。

图6 浸泡温度对三甲胺含量的影响Fig.6 Effect of temperature on the content of trimethylamine

图7 浸泡温度对感官评定值的影响Fig.7 Influence of temperature on sensory evaluation

由图6 和图7 可以看出，三甲胺的含量随着温度的升高而逐渐降低，当温度升高到35 ℃～40 ℃时，三甲胺的含量开始趋于稳定，略有波动。银鳕鱼的感官评定值随着温度的升高而增加，但当温度超过40 ℃之后，感官评分值又出现下降的趋势，分析原因主要是由于当浸泡银鳕鱼温度过高时，鱼肉蛋白质开始变性，肉质慢慢变得松散，失去了其原有的口感，且茶叶味覆盖了鱼肉本身的风味。因此，选择浸泡温度为40℃左右进行下一步试验。

2.1.4 复合脱腥剂不同去腥时间对去腥效果的影响

复合脱腥剂不同去腥时间对三甲胺含量和感官评定值的影响见图8 和图9。

图8 浸泡时间对三甲胺含量的影响Fig.8 Effects of time on the content of trimethylamine

图9 浸泡时间对感官评定值的影响Fig.9 Influence of time on sensory evaluation value

由图8 和图9所示，三甲胺的含量随着去腥时间的增加逐渐降低，当去腥时间到达30 min～40 min 时，三甲胺的含量降到最低并开始趋于稳定。随着去腥时间的增加，感官评定值先增加，当在40 min 之后，感官评定值开始出现一些不良因素干扰，总体趋势与三甲胺含量呈现负相关。原因是由于随着浸泡时间的延长，茶叶中的色素对鱼肉开始存在干扰，使得鱼肉的色泽变得暗淡，并呈现淡淡的绿色，在口感上，鱼肉由于经过长时间的浸泡，自身的风味物质有了一定的流失，并带有茶叶的气味，干扰了其原有的风味。因此，选择浸泡时间为40 min 进行下一步试验。

2.2 响应面法优化工艺参数试验结果

在单因素试验确定最优参数范围的基础上，进行Box-Behnken 响应面试验设计。试验结果见表3。

表3 优化试验设计结果Table 3 Result of optimization for process parameters

续表3 优化试验设计结果Continue table 3 Result of optimization for process parameters

采用SAS 统计软件，通过其响应面回归过程进行数据分析[13]，建立关于银鳕鱼肉三甲胺含量的二阶响应回归模型，并进而寻求最优响应因子水平。经整理，所得分析结果见表4 和表5。

表4 二次回归模型参数Table 4 Parameters of quadratic regression model

表5 回归方程方差分析Table 5 Analysis of variance of the regression equation

分析表4 和表5 可以得出，在试验范围内，4 个工艺参数中：浸泡时间对银鳕鱼肉三甲胺含量的影响最大，其次是复合脱腥剂浓度、浸泡料液比和浸泡温度，三甲胺含量回归方程的相关系数R2=98.72%，模型P值为0.001 4，说明回归的拟合程度较高。因此，银鳕鱼脱腥的最佳工艺配方可以在此基础之上得到确定。

对图中的响应面试验结果进行分析，得到关于银鳕鱼脱腥中三甲胺对复合脱腥剂浓度（A）、浸泡料液比（B）、浸泡时间（C）、浸泡时间（D）的多次二项回归方程，以三甲胺含量为响应值，经回归拟合后，由表4 可知常数项、一次项、二次项及交互项各因子对响应值的影响[14-15]，回归方程如下。

以浸泡温度和浸泡料液比为定值，进行降维分析，得到复合脱腥剂浓度和浸泡时间对三甲胺含量的响应曲面，见图10。

图10 复合脱腥剂浓度和浸泡时间对三甲胺含量影响的响应曲面图Fig.10 Response surface diagram of effects of concentration and soaking time of compound dexing agent on TMA

由图10 可以看出，复合脱腥剂浓度和浸泡时间对三甲胺含量的影响呈一抛物面，曲面有一稳定点，且稳定点为最小值。采用岭迹分析[16]，其稳定点处的三甲胺估计值见表6。

表6 稳定点处三甲胺含量估计值Table 6 Estimated value of TMA at the stable point

对表6 的优化结果进行验证试验，由验证试验得出，在复合脱腥剂浓度2.75%，浸泡料液比1 ∶11（g/mL），浸泡时间48 min，浸泡温度38.3 ℃的条件下，银鳕鱼肉三甲胺含量为16.89 mg/kg，感官评定值为91 分，表明模型预测值与验证试验结果一致性较好，此模型具有良好的实践指导效果。

3 结论

通过单因素试验和Box-Behnken 试验设计，采用SAS 统计软件，对其响应面回归过程进行数据分析，得出CaCl2和绿茶质量比为1 ∶1 的复合脱腥剂对银鳕鱼脱腥各因素影响程度分别为：浸泡时间＞复合脱腥剂浓度＞浸泡料液比＞浸泡温度，回归模型拟合度较高。得到最优工艺参数为：复合脱腥剂浓度2.75%，浸泡料液比 1 ∶11（g/mL），浸泡时间 48 min，浸泡温度 38.3 ℃。验证试验发现在该条件下银鳕鱼三甲胺含量最低，感官评定值最高。说明CaCl2和绿茶作为复合脱腥剂具有较好的脱腥效果。