不同保护剂影响植物乳杆菌冻干菌粉发酵活力的研究

赵延胜，吴超，王慧，周洪斌，董英，*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江苏 镇江 212000）

采用真空冷冻干燥技术可以提高乳酸菌的保藏期，是制备高效直投式乳酸菌发酵剂最常用的技术手段[1]。但经过冻干处理后，菌体在贮藏期间其极易遭受冷冻、氧化、融化等过程的损伤，从而影响其贮藏特性[2]。冻干保护剂的添加可以一定程度上降低菌体在冻干过程中的损伤，提高冻干菌粉的贮藏和发酵性能[3]。目前，活菌数和细胞活力是评价菌体贮藏稳定性的重要指标，而冻干保护剂的研究和开发一般多关注于冻干和贮藏过程中菌体细胞的存活率，对于保护剂影响贮藏期间乳酸菌细胞发酵活力的作用研究相对较少。

本文在前期研究工作基础上[4]，以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CGMCC 6016 ，L.P.dy-1） 为研对象，分析不同冻干保护剂对冻干菌体贮藏期间活菌数的影响，并结合流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析保护剂对菌体冻干后发酵活力的影响；在此基础上，研究贮藏过程中冻干菌粉发酵活力的变化，比较不同保护剂对冻干菌粉的保护效果，为进一步开发乳酸菌功能性保护剂，以及提高直投式乳酸菌发酵剂的贮藏稳定性，提供理论与试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L.P.dy-1：由江苏大学食品生物制造实验室自行分离；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、甘油、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、盐酸、乙醇、氢氧化钠、甲醇、百里酚酞、果糖等均为二级试剂：医药（集团）上海化学试剂有限公司；二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海生工生物工程公司；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 [5-（and 6）-car boxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE]：e-Bioscience 公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A 型鼓风干燥机：上海一恒科技有限公司；HJ-3 控温磁力搅拌器：金坛市医疗仪器厂；YX400Z 高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-ID 型超净工作台：苏州净化设备有限公司；JLQ-S1 型菌落计数器：江苏锡山市金诚仪器厂；7200型分光光度计：上海天达仪器有限公司；FD-8 真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；5430R 高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；FACSCalibur 型流式细胞仪：美国Becton Dickinson 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冻干菌粉的制备

直投式发酵剂的制备流程如下：

菌种活化→扩培→菌体浓缩分离→与保护剂混合→分装、预冻→冻干

选用质量浓度分别为10 %的菊粉、22.4 %的菊粉、菊粉复合保护剂和脱脂乳复合保护剂制备冻干菌粉[4]，将制备好的冻干菌粉经真空包装后，分别于-20 ℃和4 ℃条件下贮藏。

1.3.2 冻干菌粉发酵样品的制备

前期试验研究表明，添加不同保护剂制备的冻干菌粉发酵MRS 培养基（营养富集培养基）时，细胞活力无显著性差异，而发酵营养匮乏培养基时菌体产酸能力不同[4]。因此本试验选用10%质量浓度的菊芋浸汁用于测定冻干菌体的细胞活力，其制备过程参考程新等方法[5]，但不添加任何碳氮源及矿物元素。在34 ℃条件下，按以下方式发酵10%菊芋浸汁[6]：

1）直接活化发酵：取-20 ℃保存菌种，按5%接种量接入MRS 液体培养基中，34 ℃、12 h 活化培养两次后（活菌数为 2×109CFU/mL～3×109CFU/mL），以 5%接种量加入10%菊芋浸汁。

2）直投式发酵：采用1.3.1 中添加不同保护剂制备的乳酸菌冻干菌粉（活菌数为2×1010CFU/g～6×1010CFU/g）以0.5 g/L 的接种量加入10%菊芋浸汁。

1.3.3 无细胞发酵液的制备

每隔3 h 取1.3.2 中的发酵液于无菌离心管中，在4 ℃，3 996×g 离心 10 min 后，取上清液保存于 4 ℃，用于还原糖、总糖的测定。

1.3.4 发酵液分析方法

发酵液还原糖和总糖的测定采用DNS 比色法。还原糖测定：吸取无细胞发酵液2 mL，准确加入2 mL DNS，沸水浴3 min 后立即冷却，加入6 mL 蒸馏水，混合均匀后于540 nm 波长处测定吸光值。根据标准曲线计算样品中还原糖含量。总糖测定：吸取无细胞发酵液5 mL，用6 mol/L 的盐酸调节pH 值至2.0，沸水浴中水解1 h，然后用6 mol/L NaOH 调至pH 值为8 左右，定容至10 mL。准确吸取样品2 mL，之后操作与还原糖测定法相同。

pH 值和活菌数的测定分别采用pH 计和梯度稀释平板计数法。

1.3.5 乳酸菌增殖的测定方法

将制备的冻干菌粉直投发酵10%菊芋浸汁，初始接菌量控制在 1×107CFU/mL～3×107CFU/mL，立即取1 mL 菌液，4 ℃、3 996×g 离心 5 min，再用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤 2 次后，重悬至 1 mL，加入 100 μL 浓度为 50 μmol/L 的CFSE，37 ℃避光孵育10 min 后，离心、洗涤2 次。最终悬浮于1 mL 灭菌的10%菊芋浸汁中，34 ℃培养，并分别在6、12 h 取样，离心、洗涤，重悬于等体积的 PBS 中，过200 目滤网，采用流式细胞仪对样品进行检测。检测光源为氩离子激光，激发光和发射光波长分别为488 nm和630 nm，检测器波长为530 nm，不设门，圈定待检测的目标细胞，并通过CellQuest 软件分析细胞数据。

1.3.6 数据处理方法

采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 保护剂对冻干菌粉贮藏期活菌数的影响

在冻干菌粉贮藏过程中，温度是影响菌体存活率的关键因素之一[7]。高温及干燥条件会导致生物体内发生非酶褐变,引起菌体失活。研究报道表明，高温会加速冻干制品的融化、含水量变化和相变的发生等问题，因此温度升高，冻干样品的贮藏稳定性变差。保护剂对L.P.dy-1 冻干菌粉贮藏期间活菌数的影响见图1。

从图1 可以看出，采用不同保护剂制备的冻干菌粉在-20 ℃贮藏8 个月，活菌数均保持在1010CFU/g 以上，且不同处理组无显著差异；而在4 ℃下贮藏1 个月后，不同保护剂组的活菌数则发生变化，尤其4 ℃下贮藏6 个月时的活菌数下降最为显著。表明低温更有利于菌体活菌数的保持，该结果与已有研究报道一致[8]。

图1 保护剂对L.P.dy-1 冻干菌粉贮藏期间活菌数的影响Fig.1 Effect on the viable count of freeze-dried L.P.dy-1 during storage by cryoprotectant

此外，保护剂的种类也会影响冻干菌粉贮藏期间活菌数的变化。如图1所示，4 ℃贮藏1 个月，活菌数均保持在1.7×1010CFU/g 以上；菊粉复合保护剂组、22.4%菊粉组和脱脂乳复合保护剂组分别在4 ℃贮藏6 个月、4 个月和4 个月，活菌数仍能够维持在1010CFU/g 以上，但8 个月后菌粉活菌数降低约1 个数量级。菌粉的贮藏稳定性强弱顺序为：菊粉复合保护剂组＞22.4%菊粉组＞脱脂乳复合保护剂组＞10 %菊粉组。试验结果表明，采用菊粉复合保护剂制备的冻干菌粉贮藏稳定性最佳，且分别在-20 ℃和4 ℃保藏8 个月后，活菌数可分别达到（2.07±0.05）×1010CFU/g 和（0.94±0.17）×1010CFU/g，较其他保护剂组高。

2.2 保护剂对冻干菌粉发酵活力的影响

以直接活化发酵组作为对照，采用不同保护剂制备冻干菌粉发酵10%菊芋浸汁培养基，发酵过程中L.P.dy-1 活菌数、pH 值、还原糖及总糖的动态变化如图2所示。

图2 保护剂对L.P.dy-1 冻干菌粉发酵活力的影响Fig.2 Effect on the fermentation activity of freeze-dried L.P.dy-1 by cryoprotectant

保护剂是影响冻干后植物乳杆菌产酸能力的重要因素。由图2 可知，相比直接活化组，添加保护剂的乳酸菌冻干后发酵10%菊芋浸汁的活力均有所下降，表现在发酵过程中活菌数的增长和产酸（pH 值）速度有所降低，其中脱脂乳复合保护剂组中的活菌数一直处于最低水平，且pH 值相对较高；菊粉保护剂组相互之间无显著性差异，且在活菌数和产酸变化上较接近于活化组。

在整个发酵过程中，还原糖和总糖的含量越来越少，这与L.P.dy-1 的迅速生长和产酸相符合；发酵12 h 后，还原糖含量变化缓慢，可能是由于总糖的分解，L.P.dy-1 消耗的速度和分解产生的速度相均衡。在发酵后期，发酵液中还原糖和总糖含量几乎不变，这可能由于酸的积累造成L.P.dy-1 代谢速度降低。从试验结果可以看出，直接活化组的还原糖和总糖降低速度稍高于冻干组，菊粉复合保护剂组的糖代谢速率高于脱脂乳复合保护剂组，这与图2A、图2B 的结果相一致。

2.3 贮藏时间及温度对冻干菌粉发酵活力的影响

在贮藏期间，L.P.dy-1 冻干菌粉的发酵活力变化如图3所示。

图3 L.P.dy-1 冻干菌粉贮藏期间pH 值的变化Fig.3 Variation in the pH value of fermentation freeze-dried L.P.dy-1 with different storage time

冻干菌粉在-20 ℃保藏6 个月和4 ℃保藏4 个月后，均能够维持较高的产酸活力；随着贮藏时间的延长，菌粉的产酸能力明显下降，这可能与贮藏过程中活菌数的变化有关[9]；本试验结果同时表明，低温贮藏更有利于菌体活力的维持，该结果与已有研究报道相一致[10]。

2.4 流式细胞术对冻干菌粉发酵活力的评价

CFSE 是一种能透过细胞膜且在胞内被酯酶转化的非极性分子，当细胞分裂时，CFSE 标记物能够平均分配到两个子代细胞中，使细胞的CFSE 荧光强度减半。FCM 已被作为一种技术广泛应用于细胞领域[11]，而且可以快速的测定冻干后菌体的存活率[12]，并描述冻干菌体的生理状态[13]。因此，可利用CFSE 荧光强度的2 倍递减特性，结合流式细胞术（CFSE-FCM）检测L.P.dy-1 的增殖。试验分别采用直接活化L.P.dy-1、菊粉保护剂冻干菌粉、脱脂乳复合保护剂冻干菌粉发酵10%菊芋浸汁，分析测定发酵液中pH 值和菌体荧光强度如图4。

图4 pH 值与CFSE-FCM 测定菌体荧光强度的线性关系Fig.4 Linear relationship between pH value and the fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured

如图4所示，3 组L.P.dy-1 被显著区分，左边pH值最低的为直接活化组，中间3 组稍高pH 值的为菊粉保护剂组，右边pH 值最高的为脱脂乳复合保护剂组。pH 值与CFSE-FCM 的荧光强度之间表现出良好的相关性，R2值达到0.77，说明这两种测定指标均可用于植物乳杆菌细胞活力的分析。

将不同处理组的L.P.dy-1 冻干菌粉发酵10%菊芋浸汁，采用CFSE-FCM 分析其细胞增殖情况，结果如图5所示。

图 5 CFSE 标记 L.P.dy-1 培养 0、6、12 h 后荧光强度的变化Fig.5 The fluorescence intensity of CFSE-labeled cells in cultured 0，6，12 h

由试验结果可以看出，不同发酵时间的菌体细胞荧光强度有明显的差异，图A1～C1和图A2～C2表示随着发酵时间的延长，CFSE 标记L.P.dy-1 细胞的直方图和散点图明显向左迁移，说明荧光强度明显减弱。图5 中E 和F 代表不同保护剂制备的冻干菌粉发酵10%菊芋浸汁6 h 和12 h 时的直方图，各组之间的差异如表1所示。

表1 L.P.dy-1 随发酵时间荧光强度的变化情况Table 1 The fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured in different periods

冻干处理后菌体较冻干前（直接活化组）在6、12 h的荧光强度总体偏大。当以菊粉作为保护剂时，随着菊粉浓度的增加，制备的冻干菌体的荧光强度减弱，说明高浓度的菊粉有利于菌体的增殖。其中，与脱脂乳复合保护剂组相比，菊粉保护剂组和直接活化组之间荧光强度的差异较小。

3 结论

低温贮藏有利于维持植物乳杆菌冻干菌粉更高的发酵活力：与4 ℃贮藏条件相比，-20 ℃贮藏能够使植物乳杆菌的活菌数和产酸能力维持在较高水平；在以10%菊芋浸汁为发酵培养基条件下，以菊粉作为保护剂制备的植物乳杆菌冻干菌粉能够维持较高的发酵活力，表现在植物乳杆菌生长迅速、产酸能力强、还原糖和总糖的消耗速度快，且总体效果优于脱脂乳复合保护剂制备的植物乳杆菌冻干菌粉。

流式细胞仪能够快速评价不同保护剂处理冻干植物乳杆菌后细胞的增殖，其中菊粉保护剂组和直接活化组的细胞增殖更为接近，优于脱脂乳复合保护剂组。pH 值及CFSE-FCM 测定法的关联度良好，表明CFSE-FCM 适合冻干植物乳杆菌细胞活力的研究。