毛序棘豆生物碱成分分析

孙 暾 ,周 乐 ,王建国 ,尤延飞 ,赵世姣 ,赵宝玉

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100 ;2.新疆喀什地区草原站,新疆喀什 844000)

毛序棘豆(Oxytropis trichophora)为豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)植物,具有枯竭晚,返青早,易充分利用土地的养分、水分和光照资源,抗逆性强的特点[1],广泛分布于我国河北、山西、陕西及甘肃等省区[2],在天然草地退化严重的地方能发展成为优势种群。近年来研究人员已从该属植物中分离鉴定出140 余种化合物,以生物碱类、黄酮类、三萜类为主;此外,还有少量的木脂素、甾体等化合物。大量研究表明,共生于棘豆属植物中的内生真菌产生的生物碱对牲畜有毒副作用[3-4]。多年的临床实践表明,棘豆属植物药理活性显著,尤其广泛用于藏医和蒙医临床[5]。

近年来,由于人为和气候变化等原因,天然草地退化严重,毒草滋生蔓延,牧草资源日益匮乏。遏制毒害草蔓延,开发新的草业资源对我国农业发展和生态保护具有深远意义。虽然毛序棘豆同属棘豆属植物,但国内外对其研究主要集中在植物学特性方面,关于化学成分的研究尚未见报道,所含营养成分状况及其药用活性、毒性尚不明确。本文以采自甘肃省定西市通渭县的毛序棘豆为研究对象,对毛序棘豆进行生物碱成分分析,鉴定其所含生物碱种类,从而为后续毒理学研究及其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物样品 毛序棘豆新鲜植株2016 年8 月采自甘肃省定西市通渭县(34°55′N,104°57′E),晾干,粉碎后置阴凉处保存备用。植物样品由西北农林科技大学生命科学学院常朝阳研究员鉴定。

1.2 主要仪器与试剂 HP6890/5975C GC-MS 联用仪,美国安捷伦公司;MC 浙制02810218XMTB 数显控温水浴锅,北京市长风仪表公司;RE-52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;Canoscan LiDE 30彩色图像扫描仪,佳能公司;UV-III 三用紫外分析仪,北京炳洋科技有限公司; SHB-III 循环式多用真空泵,郑州长城科贸有限公司。硅胶GF254,青岛海洋化工厂;改良碘化铋钾显色剂现用现配;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 毛序棘豆生物碱的提取 采用工业酒精热回流法提取。取毛序棘豆干粉200 g,装入2 000 mL圆底烧瓶中加适量工业酒精于60 ℃条件下热回流提取,每次热回流4 h,连续进行直至提取液澄清无色为止。提取完毕后将各批次提取液分别减压回收,将所得浸膏合并后计算出膏率。根据生物碱的溶解性和极性依次采用酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇对工业酒精提取部分进行分段萃取。每次萃取完后,减压回收溶剂得各部分浸膏,计算出各萃取段出膏率。所得碱性氯仿和碱性正丁醇萃取物即为毛序棘豆总生物碱。

1.4 薄层色谱分析 使用自制薄层板取上述各浸膏无水乙醇溶解液,用毛细管吸取适量液体,点于距薄层板底边约0.5 cm 的起始线上,点与点之间距离保持在0.5～1 cm,样点直径小于2 mm,各样点位于同一水平位置。经反复试验后选取适宜展开剂,放入展开槽中上行法展开,展开前沿距玻璃板上端1 cm时取出用电吹风机吹干,使用改良碘化铋钾显色。

1.5 硅胶柱层析法除杂纯化 将各萃取段按质量比1∶1与柱层析硅胶充分拌匀,用氯仿湿法装柱,干法上样,后依次使用氯仿、氯仿∶乙醇(10∶1)、氯仿∶乙醇(5∶1)、氯仿∶乙醇(3∶1)、氯仿∶乙醇(1∶1)、乙醇为洗脱剂进行洗脱,样品使用薄层色谱法检测,并合Rf值相同或相近的组份。

1.6 气相色谱-质谱(GC-MS)分析 将纯化后的样品用甲醇溶解,用GC-MS 仪器检测生物碱的种类和相对含量。气相色谱条件:色谱柱为Agilent 19091S-433 HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 毛细管柱,柱温50 ℃(保留2 min),以5 ℃/min 升温至325 ℃,保持10 min;运行时间:64 min;汽化室温度250 ℃; 载气为高纯 He (99.999%); 柱前压7.65 psi,载气流量1.0 mL/min,不分流,溶剂延迟时间:3.0 min。质谱条件:离子源为EI 源;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;发射电流34.6 μA;倍增器电压1294 V;接口温度280 ℃;质量范围29～500 amu。

2 结果

2.1 毛序棘豆生物碱成分分析

2.1.1 生物碱提取及薄层色谱分析结果 使用工业酒精热回流法提取的浸膏含量为20.41 g,出膏率为10.21%。其中工业酒精热回流法提取酸性氯仿段浸膏重量为0.49 g,出膏率为2.40%;碱性氯仿段浸膏重量为0.01 g,出膏率为0.05%;碱性正丁醇段浸膏重量为1.01 g,出膏率为4.90%。

毛序棘豆工业酒精提取部分碱性氯仿萃取段,共使用了10 种展开系统进行展开,其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=10∶1∶1展开效果最好,在改良碘化铋钾显色条件下有4 个斑点;碱性正丁醇萃取段,共使用了7 种展开系统进行展开,其中V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1展开效果最好,在改良碘化铋钾显色条件下有2 个斑点。结果见表1。

表1 毛序棘豆生物碱薄层色谱分析结果

2.1.2 毛序棘豆生物碱GC-MS 分析结果 碱性氯仿经柱层析除杂后合并为1 份待测样品;碱性正丁醇段共回收56 瓶样品,经薄层色谱法分析合并为2瓶待测样品,命名为碱性正丁醇1(4-21 组分)和碱性正丁醇2(22-56 组分)。

将上述3 份样品进行GC-MS 分析鉴定,碱性氯仿部分共出峰11 个,经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2008 和Wiley275 标准质谱图,检出5 种化合物,含3 种生物碱,分别是鹰爪豆碱、二苯胍、臭豆碱(图1、表2);碱性正丁醇1 共出峰14 个;碱性正丁醇2 共出峰17 个,合并相同结果后共鉴定出17种化合物(图2 和图3);含2 种生物碱,为腺嘌呤、2-(1-吡咯烷基)-2-环戊烯-1-酮(表3)。

3 讨论

3.1 生物碱成分 生物碱为含氮碱性有机化合物,通常具有复杂的含氮杂环结构,有光学活性和显著的生理作用,往往是植物中的重要活性成分和毒性成分,有广泛的药用价值。我国学者曹光荣(1989)首次在黄花棘豆、甘肃棘豆中分离出苦马豆素[6]。葛鹏斌等陆续在小花棘豆、冰川棘豆、宽苞棘豆中分离出苦马豆素[7-9]。于荣敏等由小花棘豆、黄花棘豆中分离出多种喹诺里西啶生物碱,包括臭豆碱、野决明碱、N-甲酰基金雀花碱和鹰爪豆碱[10]。目前,研究人员已从棘豆属植物中分离鉴定出33 种生物碱,其中喹喏里西啶类8 种,吲哚里西啶类3 种,哌啶类1 种,喹啉类1 种,有机酰胺类15 种,其他类化合物5 种。近年研究表明,棘豆属植物中的喹喏里西啶生物碱和吲哚里西啶生物碱成分是该属植物毒性的主要成分,此外这两类生物碱有显著的抗肿瘤等生理活性。其中苦马豆素是目前抗肿瘤药物研究的一大热点。

表2 碱性氯仿GC-MS 检测结果

图1 毛序棘豆碱性氯仿GC-MS 总离子流图

图2 毛序棘豆碱性正丁醇1 GC-MS 总离子流图

图3 毛序棘豆碱性正丁醇2 GC-MS 总离子流图

表3 碱性正丁醇GC-MS检测结果

毛序棘豆生物碱主要集中在碱性二氯甲烷萃取段。GC-MS 检测从碱性二氯甲烷和碱性正丁醇段鉴定出鹰爪豆碱、臭豆碱、二苯胍、腺嘌呤、2-(1-吡咯烷基)-2-环戊烯-1-酮共5 种生物碱,其中臭豆碱相对含量最高,为4.49%;其次为鹰爪豆碱,含量为4.12%。研究表明,臭豆碱是棘豆属植物中主要有毒生物碱,能致家畜畸形,使胎儿流产、腭裂腿和脊柱变形,对较高等的动物有致畸作用[11],能抑制血清型为HBeAg 的乙型肝炎病毒,具有抗病毒活性。鹰爪豆碱具有显著的抗心律失常作用,能降低心肌的应激性和传导性,减慢心率,抑制心脏收缩力,曾用作抗心律失常药以治疗室性心动过速和功能性心悸[12]。臭豆碱及鹰爪豆碱均能阻断神经节,后者还能降低肾上腺皮质及颈动脉窦的反应性,这类化合物还具有兴奋中枢、抗肿瘤和杀虫等活性[12]。二苯胍为工业橡胶生产中常用的加工剂,有一定毒性。腺嘌呤是核酸的组成成分,参与遗传物质的合成。

本试验结果表明,毛序棘豆含有多种有毒生物碱成分,但还需通过动物试验对其进行毒性评价以确定毒性作用。本试验中通过苦马豆素三步显色法未能在提取物中检测出苦马豆素,由于苦马豆素极性较大,不易气化,通过GC-MS 检测并不能确定本批次样品中是否含有苦马豆素,因此毛序棘豆是否能归为疯草类有毒植物还需进一步研究。上述生物碱均为首次从毛序棘豆中鉴定出,丰富了棘豆属植物的研究内容。为毛序棘豆的毒性评价及开发利用提供了基础。