塞内卡谷病毒实时荧光RT-PCR 方法的建立

林彦星 ,徐 铮 ,曹琛福 ,黄超华 ,王 潇 ,张彩虹 ,杨俊兴,花群义

(1.深圳海关动植物检验检疫技术中心,广东深圳518045 ;2.华南农业大学动物科学学院,广东广州510642 ;3.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、塞内卡病毒属(Senecavirus)、A 型塞内卡病毒(SenecavirusA)的唯一成员,为不分节段的单股正链RNA 病毒[1]。最初SVV 被认为是一种非致病性病毒,有关SVV 的研究主要是作为溶瘤病毒用于治疗人类某些神经内分泌肿瘤[2-3]。2014 年巴西暴发大规模SVV 导致仔猪死亡,国内外养猪业对该病毒才重视起来[4-5]。2015 年我国研究人员首次分离到SVV 中国毒株并测定了其全基因组序列[6],近两年来我国先后有湖北、福建、河南、广东等省部分猪场出现SVV 感染的情况[7-9]。

该病是近年来发现的由塞内卡谷病毒感染引起猪出现水泡性病变的一种传染病。其特征是引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡,临床症状与口蹄疫(Foot-and mouth disease,FMD)、猪水疱病(Swine vesicular disease,SVD)等我国一类动物传染病相似,建立及时准确的诊断检测方法对疫病防控意义重大。目前国外已经建立了多种检测SVV 病原检测方法,如电子显微镜检查、免疫组化、RT-PCR、荧光定量RT-PCR、新型RNA 原位杂交技术等均可用于SVV 的鉴别检测[10-12]。本研究通过设计特异性的引物和探针,建立了检测SVV 的实时荧光RT-PCR 法,为有效防控塞内卡病毒病提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒、核酸样品和细胞 塞内卡谷病毒(SVV)由本室保存。水疱性口炎病毒(VSV)、猪水疱病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活病毒抗原以及PK15 细胞均由本动植物检验检疫技术中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 见参考文献[13]。

1.3 引物探针的设计 根据NCBI GenBank 中公布的SVV 基因序列(KT321458.1),针对3D 和VP1目的基因,设计多对普通RT-PCR 引物和实时荧光RT-PCR 引物及探针组合,利用BLAST 初步比较其特异性。引物探针合成后通过试验筛选并对反应条件进行优化。

1.4 病毒核酸的提取 采用病毒RNA 抽提试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit 在全自动磁珠提取纯化系统上提取病毒核酸,用50 μL 洗脱液洗脱,并用超微量核酸蛋白浓度分析仪测定所提取核酸浓度。SVV 阳性对照样品,先制备PK15 单层细胞,将SVV 接种于PK15 细胞,每日观察细胞病变,待细胞病变达75%时,收获病毒培养液,同法提取病毒核酸。

1.5 普通RT-PCR 扩增 使用一步法RT-PCR 扩增试剂盒(QIAGEN),分别以SVV、VSV-IND、VSVNJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等核酸为模板进行RT-PCR 检测,并以无核酸酶水(DEPC 水)为模板作为空白对照。RT-PCR 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 实时荧光RT-PCR 特异性试验 采用一步法荧光定量RT-PCR 试剂盒(ABI),以SVV、VSV-IND、VSV-NJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等病毒核酸为模板进行实时荧光RT-PCR 检测,并以DEPC 水作为空白对照。

1.7 实时荧光RT-PCR 灵敏度试验 用DEPC 水对所SVV 核酸做10 ×系列稀释,以稀释的核酸为扩增模板进行实时荧光RT-PCR 试验。

1.8 实时荧光RT-PCR 重复性试验 采用1.2.5中3 份不同浓度(10-1～10-3)的SVV 核酸模板进行批内重复性试验和批间重复性试验。根据Ct值变异系数(CV)进行重复性评价。

1.9 临床样品检测 利用本研究所建立的方法,对本实验室收集的116 份临床样品进行检测,并以SVV 核酸作为阳性对照,DEPC 水作为阴性对照;同时也采用普通RT-PCR 方法进行检测。

2 结果

2.1 引物探针筛选 通过试验筛选出特异敏感的普通RT-PCR 引物和实时荧光RT-PCR 引物探针(见表1)。

表1 RT-PCR 引物和探针序列

2.2 反应条件的确立 按照RT-PCR 扩增试剂盒说明书要求,在25 μL 反应体系中,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),RNA 核酸模板5 μL,用DEPC 水补足25 μL。经过对退火温度和时间的优化,确定RT-PCR 最佳反应条件:50 ℃30 min;95 ℃15 min;94 ℃30 s,52 ℃40 s,72 ℃1 min,40 个循环;72 ℃10 min。实时荧光RT-PCR 反应体系同样为25 μL,其中上下游引物各1 μL(10 μmol/L),探针0.5 μL(10 μmol/L),模板5 μL;按试剂盒推荐的反应条件:45 ℃10 min;95 ℃10 min;95 ℃15 s,60 ℃45 s(收集FAM 荧光),40 个循环。

2.3 普通RT-PCR 扩增结果 普通RT-PCR 扩增产物凝胶电泳结果显示,仅SVV 核酸模板出现约372 bp 条带,大小与预期相符,PCR 产物经测序后通过GenBank Blast 比对分析,表明扩增片段与目的基因相符,为SVV 核酸序列;其他核酸模板及空白对照均未出现扩增条带(图1)。

2.4 实时荧光RT-PCR 特异性试验结果 以SVV、SVDV、VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、CSFV 和PRRSV等核酸为模板进行实时荧光RT-PCR 特异性检测。结果显示,以SVV 核酸为模板的反应孔收集到FAM荧光信号,出现典型的扩增曲线,而其他核酸模板和空白对照都未出现扩增曲线(见中插彩版图2),表明该方法特异性强,能准确检测SVV 核酸,与其他病原无交叉反应。

图1 普通RT-PCR 扩增结果

图2 实时荧光RT-PCR 特异性检测结果

2.5 实时荧光RT-PCR 灵敏度试验结果 测得所提取核酸浓度为0.72 μg/mL。用DEPC 水将SVV核酸做10 × 系列稀释(100～10-6)进行实时荧光RT-PCR 试验,最低可以检测到本试验所抽提核酸10-4稀释度(见中插彩版图3),对应的核酸浓度为7.2 ×10-5μg/mL。

图3 实时荧光RT-PCR 灵敏度检测结果

2.6 实时荧光RT-PCR 重复性试验 取10-1～10-3稀释的共3 个浓度的SVV 核酸模板分别进行批内和批间重复性试验。根据Ct值计算出批内变异系数(CV)0.93%～ 2.47%,批间变异系数(CV)1.25%～2.76%,表明该方法重复性良好(见表2)。

表2 不同SVV 核酸浓度的重复性试验

2.7 临床样品的检测 为验证本研究建立的检测方法的临床应用价值,用所建立的实时荧光RT-PCR 法对从华南一些猪场收集和企业或养殖场送检的病猪内脏(32 份)、水疱液(13 份)、口腔拭子(54)、粪便样品(17 份)等共计116 份临床样品进行检测,并以SVV 核酸作为阳性对照。检测结果显示,7 份临床样品出现扩增曲线,其中内脏5 份,水泡液2 份,与普通RT-PCR 法检测结果一致。

3 讨论

SVV 是近年来新发现的病毒之一。虽然现有资料显示SVV 不具备FMDV 的危害性,大多数成年猪感染后预后良好,未引起严重的公共卫生后果和经济损失。但SVV 感染的临床症状类似于FMDV、SVDV、VSV 等其他几种水疱性疾病的病毒感染,使得感染猪只的上市存在重大的风险和隐患,也使疫病针对性防控带来困难。近年来SVV 在巴西、美国和我国几乎同时发生,说明有进一步扩大和暴发的可能,且局部地区传播速度快,仔猪致死率较高,其潜在影响是不可估量的,不得不引起足够的重视。我国现已有4 个省份部分猪场感染SVV 的报道[6-9],尚不知其他地区是否也存在SVV 感染情况,一旦大规模暴发可能会给我国养殖业带来严重的经济损失。因此,我国农业部制定的《2018 年兽医工作要点》中就明确提出做好塞内卡病毒病等新传入疫病的防治工作[14]。另外,我国每年都会进口大量冷冻猪肉,种猪及其遗传物质(胚胎、精液)进口数量也较大。为防止该病的新病毒株从国外传入我国,必须尽快研究建立快速检测和鉴别方法。

本研究针对3D 和VP1 基因片段较保守区,设计并通过大量试验筛选出特异敏感的普通RT-PCR引物和实时荧光RT-PCR 引物探针,建立了检测SVV 的普通RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 法。试验过程中考虑到利用体外转录的RNA 作为标准品,无法真实反应逆转录过程,且制备过程中产生的DNA残留难以去除,因此本试验利用灭活病毒作为阳性品可以有效监控病毒核酸检测的全过程,以确保检测结果的准确。通过对116 份临床样品进行检测,并以SVV 核酸作为阳性对照,检测结果显示7 份临床样品出现扩增曲线,与普通RT-PCR 法检测结果一致。本研究建立的SVV 实时荧光RT-PCR 快速检测方法具有较高的推广应用价值,可用于SVV的快速检测,对塞内卡病毒病的防控具有重要的意义。