副溶血弧菌及其噬菌体vB_VpS_PG08 的分离鉴定

丁同燕 ,孙虎芝 ,王 倩 ,付静芸 ,邱丽萍 ,宋晓娜 ,潘 强,张召佐,任慧英

(1.青岛农业大学动物医学院,山东青岛266109 ;2.青岛诺安百特生物技术有限公司,山东青岛 266109)

副溶血弧菌又称作嗜盐菌,是一种革兰阴性杆菌,分布范围广,主要来自生活在海水中的鱼、虾和贝类[1-2]。联合国粮食及农业组织(FAO)发布报告称,一种被称为“对虾早期死亡综合征(EMS)”的弧菌病导致亚洲许多国家的养殖虾出现肝胰腺萎缩甚至死亡的现象,经美国亚利桑那大学的科研人员研究表明,副溶血弧菌是引起虾感染EMS 的主要原因。中国华南地区的EMS 相对别的地处暴发较严重,在养殖过程中掉苗率较高,这给对虾的养殖产业带来巨大的经济损失[3]。副溶血弧菌主要经过虾的口腔定植在消化道,引起腹泻并破坏肠道,造成空肠空胃甚至死亡等严重问题[4]。

噬菌体具有对细菌有特异性、高效性、杀伤性等特点,只对特定的目标菌感染并裂解,是安全、绿色的生物防治主要手段[5]。噬菌体分为温和噬菌体与烈性噬菌体两类,烈性噬菌体可以在不损坏正常菌群的情况下裂解目标细菌[6]。噬菌体在杀菌的同时可以进行自我复制增殖,作为抗生素替代品已经越来越受到人们的重视[7]。在本试验中,筛选裂解谱宽的副溶血弧菌噬菌体并研究其生物学特性,扩充噬菌体储备库,为开发治疗EMS 的抗生素替代品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 分离噬菌体的样本来自山东烟台海阳养虾池的水样;副溶血弧菌标准菌株7088 来自青岛农业大学微生物实验室。

1.2 副溶血弧菌的分离培养及鉴定 取水样80 mL离心过滤弃上清,沉淀用5 mL 2216E 肉汤悬浮,取100 μL 悬浮液涂布于TCBS 平板,37 ℃培养12 h[8]。挑取蓝绿色单菌落,并使用副溶血弧菌特异性引物对疑似副溶血弧菌进行PCR 扩增检测。特异性PCR 引物来自副溶血弧菌菌株ToxR的基因,上游引物:5′-ATA CGA GTG GTT GCT GTC ATG-3′,下游引物:5′-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3′,扩增片段长度为400 bp。PCR 扩增条件:94 ℃5 min;94 ℃1 min,60 ℃1 min,72 ℃1 min,29 个循环;72 ℃延伸10 min。通过1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR 产物[9-11]。

1.3 副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定 向盛有100 mL 2 倍浓缩的2216E 肉汤的锥形瓶里加入100 mL 水样,并加入已鉴定到的10 株副溶血弧菌500 μL,37 ℃培养过夜。取出8 mL 增殖液,11 000 rmin 离心10 min,将上清通过0.22 μm 滤器过滤,得到噬菌体增殖原液。

利用双层平板法分离噬菌体,将100 μL 噬菌体原液与100 μL 宿主菌增殖液均匀混合,37 ℃孵育5 min后,取混合液置于约50 ℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7%),混匀后迅速倾倒在下层营养琼脂(琼脂浓度为1.5%)上,充分摇匀。平置至培养基凝固,37 ℃倒置培养6 -8 h。如果存在噬菌体,则在培养基上形成规则的透明圆形噬菌斑。

抠取噬菌斑置于盛有1 mL PBS 缓冲液的EP管中,42 ℃水浴30 min。将浸出液12 000 r/min 离心5 min,上清用PBS 缓冲液进行10 倍倍比稀释至合适的稀释度,使用双层平板法得到单个噬菌斑。连续纯化3～5 次,直至获得相同大小和形态的噬菌斑。

抠取形态一致的单个噬菌斑置于盛有1 mL PBS缓冲液的EP 管中,42 ℃水浴30 min。将浸出液12 000 r/min 离心5 min,取100 μL 上清与200 μL 宿主菌于5 mL 2216E 肉汤中,37 ℃摇床培养(170 r/min),试管内增殖液先浑浊后澄清,澄清后取出,进行噬菌体效价的测定[9-11]。

1.4 噬菌体的生物学特性

1.4.1 噬菌体形态观察 将10 倍浓缩噬菌体液20 μL 滴加到铜网上,静置沉降15 min 后,使噬菌体液充分进入微孔中,用滤纸吸去多余液体,在封口膜上先加15 μL 2%的磷钨酸(PTA)染色溶液,将经过的铜网倒扣在磷钨酸上,染色5 min,并用滤纸吸取过多的染液,用烤灯干燥10 min,干燥后用日立透射电子显微镜HT7700 观察[9-11]。

1.4.2 噬菌体裂解谱的测定 采用点样法进行裂解谱的测定。取100 μL 菌悬液加入5 mL 上层琼脂培养基(50 ℃),充分混匀,并迅速铺到底层琼脂板上。取噬菌体1 μL 点到双层平板上,37 ℃温箱中培养10 h[9-11]。

1.4.3 噬菌体最适感染复数(MOI)的测定 根据不同MOI 比例将噬菌体与宿主菌加入到2216E 肉汤试管中,37 ℃摇床中振荡培养3 h 至澄清,使用双层平板法测效价[9-11]。

1.4.4 一步生长曲线的测定 以MOI 为10 的比例加入500 μL vB_VpS_PG08 及500 μL 宿主菌,37 ℃孵育10 min,13 000 r/min 离心30 s。通过2216E 肉汤洗涤2 次除去未吸附的噬菌体。将沉淀置于10 mL离心管中,加入2216E 肉汤至5 mL,立即置于37 ℃摇床培养(170 r/min)。0 min 取样一次,前2 h 每隔10 min 取样一次。后2 h 每隔30 min 取一次。取出200 μL 噬菌体增殖液,12 000 r/min 离心5 min 后取100 μL 上清,10 倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价[9-11]。

1.4.5 温度稳定性试验 在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴中分别放置含有200 μL 8.7 ×108PFU/mL噬菌体的1.5 mL 离心管,每个温度设有3 个重复,作用不同时间后通过双层平板法测定噬菌体效价,绘制噬菌体对温度的敏感性曲线[9-11]。

1.4.6 pH 值稳定性试验 取效价为5.3 ×108PFU/mL 噬菌体增殖液加入到不同pH 值的PBS(pH 值2 ～13)中。 在37 ℃条件下分别作用1 h、2 h、3 h，将pH 值用HCl 与NaOH 调回为7.0，10 倍倍比稀释后测定噬菌体效价，绘制噬菌体效价在不同pH 值下随时间的变化曲线[9-11]。

1.4.7 噬菌体对紫外线的稳定性 取5 mL 效价为3.15 ×108PFU/mL 噬菌体增殖液于75 mm 无菌平皿中。 打开盖子，置于LED 紫外灯(功率15 W)下50 cm 处连续照射。 在0 s、10 s、20 s、30 s、1 min、3 min、9 min 取噬菌体液进行噬菌体效价测定，绘制噬菌体效价随紫外线照射时间的变化曲线[9-11]。

1.4.8 噬菌体对氯仿的稳定性 将增殖好的效价为2 ×108PFU/mL 噬菌体中加入2.5%的氯仿，在37 ℃摇床中振荡培养30 min，12 000 r/min 离心5 min，取上层液体测噬菌体效价，设不加氯仿的对照。 评价噬菌体对氯仿的稳定性[9-11]。

2 结果

2.1 细菌的分离 从养殖水样中进行副溶血弧菌的分离，经初步筛选共获得疑似副溶血弧菌15 株。用副溶血弧菌特异性引物进行PCR 扩增检测，鉴定出3 株副溶血弧菌。

2.2 噬菌体的分离 以副溶血弧菌标准株7088 及分离株为宿主菌进行噬菌体的分离。 经过3 代分离纯化后，噬菌体在双层平板上形成直径2 mm 左右、规则透明的噬菌斑(图1A)。

2.3 噬菌体电镜观察 电镜下该噬菌体为有尾噬菌体，由头部和尾部两部分组成，头部呈正二十面体，直径约为60 nm；有一个非收缩性尾部，长约140 nm，尾端可见明显爪刺样结构(图1B)，上述形态特征说明该噬菌体为长尾噬菌体。 根据噬菌体的宿主名称，按照噬菌体命名规则，将其命名为vB_VpS_PG08[12]。

2.4 噬菌体裂解谱的测定 噬菌体vB_VpS_PG08可裂解22 株副溶血弧菌的裂解率达32%。 22 株副溶血弧菌来自不同地区的养殖池水样，说明vB_VpS_PG08 是宽裂解谱噬菌体。

图1 噬菌体分离株形成的噬菌斑(A)、噬菌体vB_VpS_PG08电镜下形态(B)(图中标识为200 nm)

2.5 噬菌体最佳MOI 测定 如表1 所示，当MOI =0.01 时，侵染宿主菌并裂解出的子代噬菌体效价最高为2.2 ×109PFU/mL，噬菌体vB_VpS_PG08 的MOI 为0.01。

表1 vB_VpS_PG08 最适MOI 的测定

2.6 噬菌体温度稳定性试验 vB_VpS_PG08 的温度稳定性曲线见图2。 vB_VpS_PG08 在40 ℃及50 ℃基本保持原活性，在60 ℃作用20 min 噬菌体的效价从108PFU/mL 下降到106PFU/mL，作用60 min下降到104PFU/mL；70 ℃作用40 min 完全失活;80 ℃作用20 min 噬菌体完全失活。结果表明,当温度低于50 ℃时,该噬菌体较为稳定,60 ℃时随着时间延长耐受性降低,在70 ℃和80 ℃时裂解活性丧失。

图2 噬菌体vB_VpS_PG08 温度稳定性

2.7 噬菌体pH 值稳定性试验 vB_VpS_PG08的pH 值稳定性曲线(图3)。噬菌体vB_VpS_PG08 在pH 值4～10 范围内都有较高的效价,说明该噬菌体有较宽的pH 值耐受性,噬菌体在pH值2 时效价为0,而在pH 值11.0 时仍具有较高的效价,在1 h 后达到106PFU/mL,说明此噬菌体具有耐碱不耐酸的特性。在pH 值7～9 之间噬菌体的效价达到最高,表明它在该pH 值范围内最稳定,活性最强,即该噬菌体的最适pH 值为7～9。

图3 噬菌体vB_VpS_PG08 pH 稳定性

2.8 噬菌体vB_VpS_PG08 对紫外线及氯仿的稳定性 噬菌体vB_VpS_PG08 紫外线稳定性结果见图4,其显示在较短时间内紫外线对噬菌体具有较强的影响。在用紫外线灯照射9 min 后,平板上噬菌斑再没出现。噬菌体的活性不受有机溶剂氯仿影响(图5)。

2.9 噬菌体一步生长曲线 噬菌体vB_VpS_PG08的一步生长曲线(图6)。潜伏期约为20 min,暴发期约30 min,之后趋于稳定,暴发量为55。

图4 噬菌体vB_VpS_PG08 紫外线稳定性

图5 噬菌体vB_VpS_PG08 的氯仿敏感性

图6 噬菌体vB_VpS_PG08 一步生长曲线

3 讨论

细菌的严重耐药性已成为全球公共安全问题。在2011 年,世界卫生组织(OIE)提出了“遏制耐药-今天不采取行动,明天就无药可用”的呼吁[13]。我国的多重耐药细菌检出率很高,但各部门在临床应用中一直非常重视抗菌药物的控制。近几年,积极开展一系列耐药控制行动[14]。2018 年5 月26日,国家卫生与健康委员会发布了“关于持续做好抗菌药物临床应用管理有关工作的通知”,强调加快建立多学科抗菌药物管理和诊疗团队,加强抗菌药物的临床应用管理,限制抗生素的使用再次升级[15]。在水产养殖动物中使用抗生素如在人体中使用抗生素,不仅会对目标菌株产生抗药性,还会破坏机体内存在的各种正常菌群。水体是一个大环境,占地球表面积的71.9%,且大部分为咸水存在[16]。水生动物体内的耐药菌群越多,它们就越有可能传播到环境中。利用消毒剂和抗生素防治病原菌变得越来越困难,而用噬菌体防治疾病可以解决这些问题[17]。噬菌体是一种广泛存在于自然界中的病毒,可以特异性地感染并裂解细菌,且对动物和环境是绿色友好的,噬菌体及其裂解酶也必将在我国甚至世界的水产养殖业中发挥出极其重要的作用[18]。

本试验在9 月份之前是从各地养殖虾池中采集水样分离噬菌体,但效果都不是很明显。相比之下,发现在海鲜市场下水道中分离的副溶血弧菌噬菌体较多。采样地点和采样时间的分析对成功分离副溶血弧菌噬菌体有着很大影响[19]。噬菌体vB_VpS_PG08 属于有尾病毒目长尾噬菌体科,对不同来源的22 株副溶血弧菌的裂解率为32%。表明它是一株具有临床应用价值的噬菌体[20]。温度、pH值等的变化可直接对噬菌体理化性质和生物学活性产生重要影响。噬菌体vB_VpS_PG08 在低于50 ℃的温度下稳定,60 ℃时随着时间的延长耐受性降低,在70 ℃和80 ℃时失去裂解活性。噬菌体vB_VpS_PG08 在pH 值4～9 时的PBS 缓冲液中作用3 h 后仍具有较高的活性,稳定性较好。说明该噬菌体具有较宽的温度和酸碱度适用范围,可以通过向养殖池里添加噬菌体达到虾摄取药物的目的[21]。噬菌体vB_VpS_PG08 在紫外线下连续照射9 min 后,平板上再没出现噬菌斑,证明副溶血弧菌噬菌体对紫外线敏感。因此,副溶血弧菌噬菌体使用可以考虑清晨或者傍晚在鱼虾养殖池中投放,或通过包被等技术使其沉于水塘底部,以避免阳光照射引起的噬菌体活性下降[22]。

根据联合国粮食及农业组织统计,全球的水产品产量早已进入稳定的增长期。中国有近1 000 万公顷的水产养殖面积,约占世界的80%。在鱼和虾的病害方面,数量可达200 多种,所以水产养殖动物用药有着很大的潜在市场[23]。本试验从海阳养殖池水样中分离出一株较强裂解性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpS_PG08,并对其生物学特性进行了分析,为副溶血弧菌噬菌体的研究以及相关药物的开发奠定了基础。