芪芩汤对新型呼肠孤病毒试验感染雏鸭治疗效果分析

刘 佳 ,杨 颖 ,朱兆荣,2 ,刘 娟,2

(1.西南大学动物科学学院中药创新实验室,重庆荣昌402460 ;2.重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新实验室,重庆荣昌 402460)

1 材料与方法

1.1 试验雏鸭 7 日龄健康雏鸭75 只和9 日龄健康雏鸭5 只,购自荣昌县唐冲健康种鸭专业合作社,未免疫任何疫苗。自由饮水采食,隔离饲养;9 日龄鸭胚购自重庆市永健生物技术有限公司供货鸭场;病死雏鸭,来源于临床诊断病例。

1.2 药物与试剂 黄芪、黄芩、板蓝根、金银花、连翘购自重庆市迪盛医药有限公司;鸭α 干扰素酶联免疫试剂盒(20161201)、鸭β 干扰素酶联免疫试剂盒(20161201)、鸭γ 干扰素酶联免疫试剂盒(20161201)购自上海瑶韵生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备 立式压力灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SW-CJ-1FD 洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);Model 680 酶标仪(BiO-Rad Laboratories,USA)。

1.4 芪芩汤的组成和制备 将黄芪、黄芩、板蓝根、金银花、连翘以2∶3∶2∶3∶2比例依次倍比组方,清水浸泡30 min 后熬制40 min,收集滤液,重复3 次,合并药液过滤,分别减压浓缩至2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL 汤剂,-20 ℃保存备用,饲喂前温化处理。

1.5 试验方法

1.5.1 病料采集与病毒处理 采集临床病死雏鸭的肝脏、脾脏,制成匀浆,反复冻融3 次,3 800 r/min离心10 min,经孔径为220 nm 滤膜过滤的病毒液冻存备用。

1.5.2 鸭胚半数感染量(ELD50)测定及尿囊液收集 将病毒液5 000 r/min 离心5 min 后,取上清用无菌的生理盐水作10 倍系列稀释,试验采用4 个稀释梯度,即:10-5、10-6、10-7、10-8。选用20 枚健康9 日龄鸭胚进行ELD50测定,每个稀释度经尿囊腔接种5 枚鸭胚,0.1 mL/枚,观察并记录72 h 内鸭胚的死亡数,并无菌采集120 h内死亡的鸭胚的尿囊液,按Reed-Muench 计算ELD50。

1.5.3 分组与处理 75 只7 日龄雏鸭随机分成为空白组、模型组、芪芩汤高剂量组、芪芩汤中剂量组和芪芩汤低剂量组,每组15 只。空白组雏鸭皮下注射0.1 mL/只灭菌生理盐水,除空白组外每只雏鸭皮下注射0.1 mL 尿囊液,同时3 个芪芩汤剂量组分别灌喂剂量为2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL 浓缩药各1 mL,早晚各1 次,用药7 d,分室隔离饲养。

该区普查工作尚未结束，为了配合下一步普查勘查工作，本文试图通过近年来该矿床的勘查及科研成果资料，系统的阐述矿区内地层、构造、岩浆岩、围岩蚀变及矿体地质特征,结合典型矿脉（体）的解剖, 总结区内找矿标志，对下一步普查勘查及幕阜山岩体西南缘稀有金属优选靶区有着指导作用。

1.5.4 临床症状及病变观察 试验期间每日进行临床观察,记录临床症状,统计并比较各组发病情况,并对发病死亡的雏鸭剖检,观察并记录各组肝和脾脏等器官的肉眼变化。

1.5.5 病理组织学观察 将采集的部分组织样品置于10%中性福尔马林缓冲液中固定,常规方法制备石蜡切片,H.E.染色后观察其组织病理学变化。

1.5.6 样品的采集及检测 分别于注射NDRV 并用药后第1、4、8 天各组采集10 只雏鸭静脉血,分离血清,ELISA 测定IFN-α、IFN-β 及IFN-γ 含量。

1.5.7 数据处理 试验数据用SPSS2.0 软件进行单因素方差分析,用LSD 多重比较法对数据进行显著性检验,显著性水平设为P<0.05。

2 结果

2.1 病毒的鸭胚半数致死量(ELD50) 由表1 可知,按Reed-Muench 法计算得出ELD50=10-6.84/0.1 mL。

表1 9 日龄鸭胚ELD50测定(接种剂量0.1 mL/只)

2.2 芪芩汤对NDRV 病雏鸭存活率的统计 从表2 可知,空白组雏鸭全部存活。与空白组相比,模型组雏鸭存活率(40%)降低,差异极显著(P<0.01)。与模型组相比,芪芩汤高剂量组、中剂量组、低剂量组雏鸭存活率升高,差异显著(P<0.05)。

表2 各试验组雏鸭存活率

2.3 雏鸭的临床症状及剖检变化 结果显示,空白组雏鸭在整个试验观察期均无异常反应,剖检未见肉眼可见的病变;模型组雏鸭表现为精神沉郁,食欲减少或废绝,不愿走动,拥挤成堆,拉黄白色或绿色带有黏液的稀粪,肛门周围有大量稀粪粘着,泄殖腔扩张、外翻,部分鸭趾关节或跗关节肿胀,脚软,有腹腔浆膜炎症状。剖检变化为:发病初期,模型组雏鸭脾脏肿大出血,呈圆形或不规则分布,质脆(见中插彩版图1-A),发病后期鸭脾脏肿大,严重坏死(见中插彩版图1-B),可见黄白色坏死灶并有黄色假膜(见中插彩版图1-C)。肝脏肿胀出血,表面分布有白色坏死点(见中插彩版图1-D)。芪芩汤

高、中、低剂量组未见明显的异常表现,剖检未见肉眼可见的病变。

图1 感染NDRV 雏鸭剖检的病理变化

图2 模型组、空白组和用药组雏鸭脾脏病理组织学变化

2.4 雏鸭的组织病理学观察 结果显示,空白组雏鸭脾脏组织结构正常,未见异常组织病理变化(见中插彩版图2-B)。雏鸭感染NDRV 后,病理组织学变化以脾脏为主,可观察到脾脏坏死灶可见有炎性细胞、多核巨细胞浸润形成肉芽肿(见中插彩版图2-A)。芪芩汤高、中、低剂量组雏鸭脾脏切片均未出现如模型组一般的病变组织肉芽肿结构(见中插彩版图2-C)。

2.5 芪芩汤对NDRV 病雏鸭血清中IFN-α、IFNβ、IFN-γ 的影响 由表3 可知,与空白组相比,试验第4、8 天,模型组雏鸭血清中IFN-α 含量降低,其中在第4 天差异显著(P<0.05),在第8 天差异极显著(P<0.01)。与模型组相比,试验第8 天,芪芩汤高剂量组雏鸭血清IFN-α 含量升高,差异极显著(P<0.01);试验第4、8 天,芪芩汤中剂量组和低剂量组雏鸭血清IFN-α 含量升高,差异极显著(P<0.01)。

由表4 可知,与空白组相比,试验第1、4 天,模型组雏鸭血清中IFN-β 含量有升高的趋势,试验第8 天IFN-β 含量有降低的趋势,但差异不显著(P>0.05)。与模型组相比,试验第4、8 天,芪芩汤高、中剂量组雏鸭血清中IFN-β 含量升高,差异极显著(P<0.01);试验第4、8 天,芪芩汤低剂量组雏鸭血清中IFN-β 含量升高,其中在第4 天差异显著(P<0.05),在第8 天差异极显著(P<0.01)。

由表5 可知,与空白组相比,试验第1、4、8 天,模型组雏鸭血清中IFN-γ 含量降低,其中在第1 天差异显著(P< 0.05),在第4、8 天差异极显著(P<0.01)。与模型组相比,芪芩汤高、中剂量组雏鸭血清中IFN-γ 在第4、8 天含量升高,差异极显著(P<0.01);芪芩汤低剂量组雏鸭血清中IFN-γ 含量在试验第1、4、8 天有升高的趋势,但差异不显著(P>0.05)。

表3 NDRV 病雏鸭血清中IFN-α 含量的变化(,ng/L,n=10)

表3 NDRV 病雏鸭血清中IFN-α 含量的变化(,ng/L,n=10)

表4 NDRV 病雏鸭血清中IFN-β 含量的变化(,ng/L,n=10)

表4 NDRV 病雏鸭血清中IFN-β 含量的变化(,ng/L,n=10)

表5 NDRV 病雏鸭血清中IFN-γ 含量的变化(,ng/L,n=10)

表5 NDRV 病雏鸭血清中IFN-γ 含量的变化(,ng/L,n=10)

3 讨论

脾脏是机体内最大的外周免疫器官,脾脏一旦损伤,必然会导致免疫细胞发育和功能出现障碍,影响脾脏的免疫功能[12],而病理剖检和病理组织切片能客观、快速的显示组织损伤或修复情况[13]。本试验结果显示,受NDRV 感染雏鸭脾脏肿胀,表面有出血和坏死,组织病理学观察到脾脏坏死区出现“肉芽肿”结构,与文献[14]结果一致。给予芪芩汤治疗后,雏鸭脾脏组织未出现明显异常的组织病理学变化,说明芪芩汤能够抑制NDRV 对免疫器官的损伤,具有保护雏鸭抗感染的作用。

新型呼肠孤病毒辩证属瘟热毒邪入侵、由表及里,内侵于脾胃肝胆,宜清热解毒、保肝利胆、扶正祛邪。故选用黄芪、黄芩、板蓝根、金银花、连翘等组成的中药复方制剂芪芩汤,具有清热解毒、利水消肿之功效。方中黄芪补气升阳、利水消肿治其本,黄芩清热燥湿、泻火解毒,板蓝根清热解毒、利咽消肿,诸药合用共奏扶正祛邪之功效。存活率是反映试验药物对靶动物是否真实可靠最直接的指标[15]。本试验结果显示,感染NDRV 雏鸭的存活率为40%,芪芩汤高剂量组、中剂量组、低剂量组雏鸭存活率分别为86.87%、80%、66.67%,说明芪芩汤可提高雏鸭的存活数,对新型呼肠孤病毒具有一定的治疗作用。

NDRV 进入机体后能快速诱导宿主中干扰素的产生[16]。干扰素分为I 型和II 型两类,I 型干扰素主要通过诱导细胞表达抗病毒蛋白来发挥作用,II型干扰素抗病毒功能稍弱,但其免疫调节功能较强[17]。IFN-β 和IFN-α 在先天免疫中发挥着重要的作用,IFN-α 主要是通过控制病毒基因组转录、切割病毒RNA 以及阻止翻译来抑制病毒的感染[18]。此外,IFN-α 可以刺激机体的免疫应答间接发挥抗病毒作用[19]。本试验结果显示,试验第4、8 天时,模型组雏鸭血清中IFN-α 含量显著降低,推测病毒入侵机体后会抑制雏鸭机体内IFN-α 的产生,从而阻断IFN-α 抗病毒效应。给予芪芩汤治疗后,雏鸭血清中IFN-α 含量显著升高,推测芪芩汤能够提高雏鸭血清中IFN-α 的含量来参与先天性抗病毒反应。IFN-β 由成纤维细胞和病毒核酸等物质诱导产生,具有广谱的抗病毒作用[10]。在病毒感染起始阶段,它会通过自分泌和旁分泌两种方式起作用,来防止病毒的复制与传播[20]。本试验结果显示,试验第1、4 天雏鸭血清中IFN-β 呈现升高的趋势,到试验第8 天雏鸭血清中IFN-β 呈现降低的趋势,结果表明,NDRV 在组织细胞内大量增殖,雏鸭的免疫功能受到一定的损害。而经芪芩汤治疗后,3 个剂量组雏鸭血清中IFN-β 含量显著升高,提示芪芩汤促进雏鸭机体内产生IFN-β,调节免疫应答清除体内病毒,使病毒数量先升高后降低,抑制病毒的复制与传播,从而降低对雏鸭免疫器官的损害。

IFN-γ 能干扰大多数病毒的产生,在刺激巨噬细胞产生促炎性因子和激活NK 细胞的免疫调节起着重要的作用[21]。初次感染NDRV 病毒时,感染的细胞会产生IFN-γ,虽然不能直接抑制细胞中病毒的复制,但IFN-γ 能诱导细胞产生抗病毒蛋白,从而阻止病毒在细胞内繁殖[22],而机体内的IFN-γ 减少会使上述过程受阻,NDRV 病毒大量扩散。本试验结果显示,NDRV 感染后雏鸭血清中IFN-γ 含量显著降低,提示NDRV 破坏了雏鸭的免疫系统,而芪芩汤治疗可以显著提高NDRV 雏鸭血清中IFN-γ 的含量,说明芪芩汤对IFN-γ 有显著的调节作用,恢复或增强病鸭的免疫应答,从而发挥保护机体的作用。

综上所述,芪芩汤能够减轻感染雏鸭的临床症状与病理变化,调控NDRV 感染的雏鸭体内IFN-α、IFN-β、IFN-γ 的分泌从而达到防治NDRV 的作用,但其如何调控机体内干扰素的变化,还待进一步的研究。