2017 -2018 年山东省猪流行性腹泻病毒ORF3 基因型分析

(山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南 250022)

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病。该病毒主要破坏猪的消化道器官,其主要临床症状为急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水。1971年,英国首次报道了PED 的发生[1]。1978 年,英国和比利时首次鉴定PEDV 的基因组大小约为28 kb,是具有感染性的、有囊膜、不分节段的、单股正链RNA 病毒。PEDV 基因组从5′→3′依次为5′端非编区(5′untranslated region,UTR),6 个开放阅读框(Open reading frames,ORFs)和3′UTR,其中5′端含有帽子结构,3′端含有Poly(A)尾巴,6 个开放阅读框包括复制酶基因(ORF1a,ORF1b)和结构基因(S、ORF3、M、N)[2]。ORF3 属于附属蛋白,在病毒复制的过程中,一般不需要附属蛋白的参与,但附属蛋白的表达可能对病毒适应体外培养过程产生影响。将病毒在细胞上进行连续传代后,就很容易从中挑选出附属基因缺失的毒株,而其缺失可以导致病毒的至弱[3],因此现认为ORF3 蛋白的功能与病毒的毒力有关,并为强、弱毒株提供了鉴定依据。

本试验对2017 年1 月-2018 年6 月山东省13地市仔猪临床表现为腹泻症状的规模化猪场开展了病原检测和ORF3 基因分析,为更好的PEDV 防控提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 研磨仪、PBS、离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪、AB 荧光定量PCR 仪,均由本实验室提供;病毒DNA/RNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、pMD18-T Simple Vector、克隆宿主菌E.coliDH5α 感受态细胞、DL-2 000 DNA Marker,均购自TaKaRa 公司。

1.1.2 引物设计 参照GenBank 已登录的PEDV序列JQ282909 的ORF3 基因,利用Primer 5.0 设计PEDV 的ORF3 基因扩增引物(ORF3f:5′-CCTAGACTTCAACCTTAC-3′;ORF3r:5′-GAAAAAGAGTACGAAAAG-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 于2017 年1 月-2018 年6 月,从山东省德州、泰安、烟台、济宁、济南、日照、菏泽、临沂、滨州、潍坊、聊城、淄博和东营13 个地市猪场采集腹泻仔猪的小肠及内容物、新鲜粪便和血清等样品共105 份。

1.2.2 RNA 的提取 将采集的猪小肠及内容物、粪便放入1.5 mL 离心管中,加入磁珠、1 mL PBS,用组织研磨仪研磨,离心取200 μL 上清。按照AxyPrep 体液病毒RNA Extraction Kit 步骤进行RNA的提取。

1.2.3 阳性病料的筛选和ORF3 基因的扩增与克隆 利用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒三重实时荧光RT-PCR 检测试剂盒(世纪元亨)将鉴定阳性的病料用于ORF3 基因的克隆。用PEDVORF3 引物对样本进行PCR 扩增,反应体系为50 μL。模板RNA 2 μL,RNase Free dH2O 17 μL,2 ×1 Step Buffer 25 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL,上下游引物各2 μL。条件:50 ℃30 min,95 ℃5 min,1 个循环;94 ℃30 s、50℃30 s、72 ℃30 s,30 个循环;72 ℃10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,筛选出阳性样本。胶回收产物连接于pMD18-T 载体中,将鉴定结果为阳性的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4ORF3 基因的遗传进化分析 将获得的序列命名并上传NCBI 数据库,利用Meg Align 软件将本试验获得的ORF3 基因序列与我国其他地区的代表株、国外分离株及PEDV 经典株的ORF3 基因进行同源性分析比对并构建遗传进化树。

2 结果

2.1ORF3 目的基因扩增与序列测定 2017 -2018 年,来自山东省13 个不同地市的105 份腹泻病料中,利用M 系列引物检出68 份阳性,年均检出率为64.8%。利用ORF3f 与ORF3r 一对特异性引物筛选出28 株具有代表性的阳性病毒株。将筛选出的28 株ORF3 序列连接T 载体测序,从中扩增ORF3 全基因,大小为675 bp,部分电泳结果见图1。

图1 PEDV ORF3 基因的RT-PCR 扩增结果

2.2 基因序列比对 利用Meg Align 序列比对发现未出现基因的缺失,只是发生个别基因的突变。28 株ORF3 基因彼此同源性为94.2%～100%,编码氨基酸同源性为94.7%～99.6%。与欧洲经典毒株CV777 基因同源性为95.4%～96.9%,氨基酸同源性为94.4%～96.0%。28 株序列号分别是MH580562-MH580589。毒株的详细信息见表1。

与CV777 相比,本试验获得的28 个ORF3 序列在8 个位点发生相同的氨基酸的变异(A21V,I54V,I79V,F92L,V80S,I101A,S166N),同时还存在一些特异性的突变(L3S,G4W,L5T,Q7S,T9M,L25S,I70M,L72S,L81I,L132P,G150V,N168D,H182Q)。与疫苗株Attenuated Chinese PEDV 相比,不存在82～99氨基酸位点上18 个氨基酸的连续缺失现象,结果验证本试验分离得到的28 株序列均为野毒株。

表1 分离毒株信息

2.3ORF3 全基因遗传进化分析 将28 株本试验分离的ORF3 基因与NCBI 已上传部分ORF3 基因做遗传进化分析(表2),遗传拓扑图(图2)呈现2 个明显的分枝,经典毒株与弱毒株代表的G1 和当代流行毒株群代表的G2。G1 包含2006 年在甘肃分离得到的中国毒株LZC 和1978 年在比利时首次发现的PEDV 欧洲株CV777,以及1 个韩国弱毒株和3 个中国弱毒株。野毒株群G2 包含2 个分枝,以韩国野毒株和中国野毒株为代表的2-1,和以山东毒株与华南毒株为代表的2-2。本试验分离的22 株野毒株与5 株韩国流行株和3 株中国流行株聚类于2-1 分支中,拓扑图显示,该分支病毒是由韩国经典毒株Virulent DR13 变异而来。其余6 个山东省流行毒株与2011 -2012 年分离得到的5 个广东野毒株和1 个福建野毒株聚类在一起,拓扑图显示,该分支的山东省流行病毒株和广东省流行病毒株与福建省的P9 病毒株起源于共同的祖先。

表2 参考序列信息

3 讨论

PEDV 属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus),是有囊膜的不分节段的单股正链RNA 病毒[4-5]。多项研究证实,PEDV 毒株目前只存在1 种血清型[6]。自PEDV 流行以来,成为造成仔猪腹泻死亡的主要原因[7],即使在免疫猪场,感染该病毒的仔猪死亡率高达100%[8],给养猪业带来巨大经济损失。本试验对山东省13 地市发生腹泻的猪进行临床诊断和PCR 技术相结合,确定2017 -2018 年PEDV 在山东的流行情况。

图2 PEDV ORF3 遗传进化分析

PEDV 病毒目前分为3 个基因型:经典型、弱毒型和流行型[9]。其ORF3 基因在病毒进化史上相对保守,但不同流行地区野毒株的ORF3 基因也存在一定的特异性差异,因此开展ORF3 基因的分子流行病学调查,对于PEDV 的区域性防控具有重要意义。本试验获得的28 株野毒株PEDVORF3 基因测序结果显示,ORF3 基因只存在个别位点的突变,没有发生缺失和插入,大小均为675 bp,编码224 个氨基酸。遗传分析显示,2 -1 分支与经典毒株CV777和LZC 亲缘关系较远,但与韩国毒株亲缘关系较近,病毒是否由韩国流入还需进一步证实。虽然进化树拓扑图显示,山东和广东的流行毒株与福建P9具有相同的进化地位,但2-2 分支毒株最早出现在中国广东[10-11],并在华南个别省份持续存在2 年左右。这一类型PEDV 流行株具有强致病性,引起仔猪100% 高死亡率。2015 年在山东省被检测发现[12],直到现在该分支病毒仍在山东境内流行,其他地区再无报道。

由此我们得出2 点推论:推论1,是否2-1 亚型分支是由2-2 分支病毒变异而来? 2-1 与2-2 分支比较来看,2-2 分支的进化地位较2-1 靠前,病毒序列比较保守,没有引起大规模疫病的流行,只是散状零星发生。推论2,2-2 亚型是否适合做我国PEDV疫苗的备选毒株? 除了广东、湖北、福建和山东四省检测到该亚型的病毒,其他地区包括国外均无报道,且从2013 年以来,华南没有再发生该亚型引起的家畜PEDV 感染事件。毕竟地域不临近,我们无法推测山东省检测到的2-2 亚型是从华南流入本地,但是该亚型毒株流行较慢,序列较保守,是否适合研发成新的PEDV 疫苗株还需进一步理论和试验验证。山东省是农畜产品生产和交易大省,大量的畜产品交易再加上交通运输环节的防护和消毒的不到位,给疫病防控增加了重重困难。总之,这种现象警示我们应注意这一基因型病毒的流行和变异情况,预防该基因型PEDV 的大规模暴发。