双价RNA 干扰载体的构建及dsRNA 体外饲喂褐飞虱的研究

杨 颖，王爱娜

(渭南职业技术学院，陕西 渭南 714026)

褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)，半翅目飞虱科属，是农作物水稻最具破坏性的农业害虫，主要通过直接吸食水稻韧皮部汁液传播水稻草状矮化病毒［1］，目前防控飞虱的主要措施仍以化学防治为主［2］，尽管利用杀虫剂较为便捷，但也存在广泛使用造成环境污染，飞虱抗药性的产生，由于其非选择性的灭杀对一些有益生物也是有害的，例如传粉昆虫和自然天敌［3］，而不加选择性的使用杀虫剂尤其是在作物早期，也会引起刺吸式害虫的大爆发［4］。因此，选择抗性靶基因，采取新的防治手段，对褐飞虱治理具有重要意义。

RNA 干扰(RNA interferenee，RNAi)作为一种重要基因沉默机制，可通过dsRNA 的介导，高效特异性降解目的基因的mRNA，抑制(Knockdown)目的基因的表达。目前利用RNAi 技术对于昆虫的研究，主要利用注射或饲喂的方法，将dsRNA 或siRNA 导入昆虫细胞或活体昆虫体内从而实施干扰［5］，通过检测靶基因的沉默效率或相应生物表型分析从而研究相应基因功能，为进一步筛选出可有效防控害虫的基因资源提供了保障。孟山都公司Baum 等研究发现，利用表达玉米根叶甲VATPase 基因dsRNA 的转基因玉米，饲喂玉米根叶甲幼虫，幼虫出现发育受阻或死亡现象［6］。

V-ATPases 是一类ATP 驱动的质子泵，存在于真核生物细胞质膜和细胞器内膜上，通过ATP水解产生的能量，将H +泵出包膜形成跨膜质子梯度，维持细胞正常生理活动，在胞内外pH 环境，离子和代谢物的转运中发挥着重要作用［7，8］。此外V-ATPases 是由多个亚基构成的功能性复合物，该复合体包括V1 和V0 两大结构域，位于外周的V1 由8 个亚基组成，负责催化ATP 水解，跨膜的V0 结构域由6 个亚基组成，负责质子转移［9，10］。为利用RNAi 技术进行褐飞虱防治，本研究将褐飞虱V-ATPase D 亚基基因片段和VATPase H 亚基基因片段进行融合，获得约800 bp的V-ATPase D-H (VAD-H)融合基因，其以反向重复方式连入经改造含有Pdk 内含子的中间载体pUCm-T。通过重组PCR 将上述两种基因融合后构建具有反向重复发夹结构的RNAi 表达载体，旨在为利用RNAi 技术培育双价转基因抗虫水稻新种质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 本试验饲养飞虱所用水稻材料为日本晴水稻，褐飞虱由本校植物抗逆研究中心提供，在光照培养箱内(温度25 ±2 ℃，相对湿度70%～80%，15 h 光照/9 h 黑暗)利用水稻幼苗进行饲养繁育。后续生测实验中，选取同龄期幼虫并分成3 组每组20 只左右。

1.1.2 主要试剂 试验所用大肠杆菌(Escherichia.coli)菌株DH5α，载体pUCm-T 均由本实验室保存和提供。引物由擎科生物合成，RNA 抽提试剂Trizol 购自Invitrogen 公司，MEGAscriptTM T7 Transcription Kit (ambion，AM1334)转录试剂盒购自ThermoFisher scientific 公司，Ex Taq、内切酶和T4 ligase 购自Takara 公司，cDNA 合成和qPCR 试剂盒均购自全式金公司。

1.2 试验方法

1.2.1 V-ATPase D-V-ATPase H(VAD-H)融合基因的获取 利用半翅目点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)的vacuolar H+ATPase subunit 氨基酸序列(Genebank:BAN20615)，作为探针在褐飞虱数据库中进行tBlastn 检索，发现褐飞虱的V-ATPase H 亚基基因序列(GenBank:XM _022328393.1)，根据该基因不同转录本选其共有序列，以及褐飞虱V-ATPase D (GenBank:XM_022330230)基因的保守序列分别设计特异性扩增引物(表1)，采用重组PCR 扩增获取V-ATPase D-V-ATPase H(简称VAD-H)的融合基因。以3 龄飞虱若虫cDNA 为模板，VAD-H-α-F1 和VAD-H-α-R1 为引物，扩增获取V-ATPase D 亚基的基因片段;以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 为引物，扩增获取V-ATPase H 亚基基因片段，再以PCR 扩增产物V-ATPase D 和V-ATPase H 亚基基因为模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R2 为引物进行重组PCR，扩增VADH 融合基因。

图1 hp(VAD-H)结构示意

PCR 反应体系:2 ×Prime STAR Buffer (Mg2+Plus)12.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μl)0.5 μl，10 μmol·L-1上游引物0.5 μl，10 μmol·L-1下游引物0.5 μl，模板0.5 μl，加ddH2O 至25 μl。PCR 反应:98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸50 s，30 个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收并纯化后，将融合基因片段连入pMD19-T 载体，得T-VAD-H 并测序验证。

表1 引物序列

1.2.2 dsRNA 的体外合成 上述获得的VAD-H 融合基因，在扩增该序列所设计的特异性引物VAD-H-F1、R2 的5'端分别加上T7 启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，以及添加T7 启动子序列的dsGFP F 和dsGFP R(表1)，利用试剂盒MEGAscript T7 Kit (ambion，AM1334)在体外分别进行干扰片段VAD-H 的dsRNA 和dsGFP 合成。

1.2.3 体外饲喂dsRNA 通过体外饲喂法进行飞虱RNAi 研究，选TN1 水稻幼苗上的3 龄褐飞虱生测，体外实验所用飞虱先经过2 d 人工饲料(未加dsRNA)喂食适应再进行dsRNA 饲喂。喂食含400 ng·μL-1ds-VAD-H 的人工饲料为试验组，添加400 ng·μL-1dsGFP 的作为对照组，每天按时更换人工饲料。褐飞虱饲喂采用双通玻璃管，其一端用parafilm 膜密封，另一端采用双层parafilm 膜中间添加人工饲料而成，管内接入生长发育一致的3 龄待测褐飞虱，每管接入30 头，重复3 次，每天记录飞虱存活率和生长发育情况。实验在人工气候室中进行，实验条件:温度27 ±1℃，湿度75 ±5%，光照周期为16 h 光照，8 h 黑暗。

1.2.4 实时定量RT-PCR 分析检测 用Trizol提取总RNA，经反转录试剂盒(TransScript One-step cDNA Synthesis SuperMix)合成cDNA。将合成的第一链cDNA 稀释10 倍后作为模板，进行定量检测，所用引物为如表2 所示。qPCR 反应体系为20 μL:2 ×TransStart Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL，Forward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR反应程序为:94℃30 s;94℃5 s，60℃30 s，40 个循环。Real-Time qPCR 所用的仪器为ABI Prism 7300，选用揭飞虱β-actin 基因(GenBank:EUl79846)作为内参，基因相对表迖量计算采用Livak 和Schmittgen［11］的方法。

2 结果与分析

2.1 重组PCR 扩增获取VAD-H 融合基因

以3 龄飞虱若虫cDNA 为模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R1 为引物，扩增获取了约400 bp 的V-ATPase D 亚基基因片段。以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 为引物，扩增获取400 bp的V-ATPase H 亚基基因片段。再以PCR 扩增产物V-ATPase D 和V-ATPase H 亚基基因为模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R2 为引物进行重组PCR，扩增获得约800 bp 的VAD-H 融合基因片段(图2)。将融合基因片段连入pMD19-T载体，经测序验证，所得序列为基因重组序列(图2)。

图2 VAD-H 融合基因片段的PCR 扩增

2.2 pUCm-hp(VAD-H)重组载体构建

为获取发夹结构的RNAi 载体，利用经改造含有Pdk 内含子的中间载体pUCm-T 构建干扰片段的发夹结构。采用限制性内切酶Sac I 和Kpn I 对T-VAD-H 质粒进行酶切，获得大小为800 bp 的融合基因片段VAD-H，酶切片段回收后连入经Sac I/Kpn I 酶切的pUCm-T 载体，获得pUCm-T-VAD-H-Intron 重组载体。再用Sal I 和Xho I 对重组载体T-VAD-H 进行酶切，酶切片段回收后连入经Sal I/Xho I 酶切的重组载体pUCm-T-VAD-H-Intron，获取含有发夹结构的pUCm-hp(VAD-H)重组载体(图3)。

图3 pUCm-hp(VAD-H)载体结构示意图

2.3 体外喂食dsRNA 后褐飞虱的存活率

选取生长发育一致的3 龄飞虱若虫，用人工饲料饲喂2 d 后再用于dsRNA 饲喂试验，持续8 d后各处理存活的若虫均羽化变为成虫。测试用融合基因VAD-H 的dsRNA 通过体外合成，添加到人工饲料中浓度为0.4 μg·μl-1，与对照组进行比较，从第2 天开始处理组飞虱存活率便出现降低，当饲喂至第8 天时VAD-H 干扰组存活率仅为48.3%，并且VAD-H 干扰组与对照组差异显著(图4)

图4 饲喂dsRNA 后褐飞虱的存活率

2.4 体外喂食dsRNA 后对飞虱靶基因影响

为检测飞虱取食dsRNA 后对其体内靶标基因mRNA 的影响，利用荧光定量PCR 对靶基因的转录水平进行测定，实验所用飞虱为上述喂食添加dsGFP 的对照组和添加dsRNA 试验组，4 到8天后选取生长发育一致的褐飞虱，分别抽提RNA反转录为cDNA 后，用qRT-PCR 检测褐飞虱体内靶基因的相对表达量。

持续饲喂dsRNA 4 d、6 d 至8 d 后，褐飞風体内靶标mRNA 水平均发生不同程度的降低，降低水平随着饲喂时间的延长而升高。如图5 靶基因的转录水平从第4 天开始降低，饲喂至第八天飞虱靶基因V-ATPase D 转录水平降低了47.6%，靶基因V-ATPase H 的转录水平降低了29.7%(图5)。

图5 饲喂dsRNA 后褐飞虱靶基因表达量(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01.)

3 讨论

目前利用RNAi 进行昆虫功能基因的研究主要通过注射法和饲喂法。Liu 等利用显微注射向褐飞虱体内注射组成型表达的钙网蛋白(Calr)和肠道特异蛋白(Ctsb)基因的dsRNA［12］，注射后第4 天两种基因表达水平均降低了40%左右。Chen等利用添加靶基因海藻糖磷酸合酶(NlTPS)dsRNA 的人工饲料饲喂褐飞虱［13］，使该基因在mRNA 水平和酶活性显著降低，此外随着饲喂时间延长褐飞虱发育水平也受到影响，甚至出现死亡。上述研究表明dsRNA 进入褐飞虱体内后能够特异性地沉默相关靶基因，由于注射法对飞虱、蚜虫等体型较小的昆虫易造成机械损伤，死亡率较高，因此本实验采用人工饲料喂食法。

笔者研究将褐飞虱V-ATPase D 亚基基因片段和V-ATPase H 亚基基因片段进行融合，获得约800 bp 的融合基因，构建针对该融合基因的RNAi 干扰载体。相比于之前有关RNAi 抗虫研究，只针对单个目的基因，本实验通过基因融合形成新的干扰基因片段，同时构建了双价干扰载体。褐飞虱取食添加有融合基因VAD-H dsRNA 的人工饲料，饲喂8 天后褐飞虱死亡率为51.7%，与对照相比差异显著(图3)，此外我们对取食dsRNA的褐飞虱靶标基因转录水平，进行荧光定量PCR，结果表明实验组体内相关基因表达量与对照相比显著下降(图5)，表明摄入体外表达的融合基因dsRNA，能够引发褐飞虱体内RNAi 效应。

由于人工饲料饲喂时添加dsRNA 的浓度与虫体RNAi 呈剂量效应，因此当外界不能持续提供dsRNA 时，干扰效果会受到限制。因此本研究后面将通过构建RNAi 植物表达载体，获取体外稳定表达dsRNA 的植株，进一步验证转基因植物抗飞虱方面作用。