黑茶发酵过程中微生物多样性研究进展

徐正刚， 吴 良， 刘石泉, 黄慧敏， 董 萌， 赵运林

(1. 湖南城市学院 材料与化学工程学院黑茶金花湖南省重点实验室， 益阳 413000；2. 中南林业科技大学 湖南省环境资源植物开发与利用工程技术研究中心， 长沙 410004)

中国是世界上最早发现和培育茶树的国家, 茶叶种类很多，基本茶类分为6大类：绿茶、红茶、乌龙茶、黄茶、白茶和黑茶[1]。现代医学证明，茶叶不仅可以作为饮品饮用，还有很多保健功效。茶叶中富含多种营养物质，如儿茶素、氨基酸、茶多酚、茶多糖等，这些物质使得茶叶具有防氧化[2]、促消化、抗细菌感染、调节肠道微生物平衡、抗癌、防止心血管疾病、降脂减肥、杀菌消炎、利尿解毒、醒酒等诸多营养和保健功效[3-4]。

黑茶是6大茶类之一，属于后发酵茶，生产历史悠久，是我国特有的一大茶类[5]。按照原料和制作工艺的不同，可分为紧压茶、花卷和散装茶3类：紧压茶主要有茯砖茶、青砖茶、六堡茶等；散装茶有黑毛茶、普洱茶等；花卷主要是千两茶等。

随着方法和技术的进步，微生物群落结构、多样性研究在许多领域广泛开展和应用，但在黑茶发酵工艺中的研究没有得到应有的重视。对于黑茶中的优势菌分类地位一直存在争议，以前受制于技术条件限制，科研工作者更多是通过微生物形态和生理生化特征等表型或者镜检图片进行分类鉴定。由于各种黑茶产地、渥堆、发花工艺，检测方法、时间季节的不同，分类鉴定结果不尽相同，甚至争议很大，直到齐祖同以菌株有性型为模式命名的原则，将“金花菌”命名为冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，才获得了业界大部分人的承认[6]。黑茶作为一款独特的微生物发酵茶，微生物对黑茶独特品质的形成势必起到重要作用，但是大部分文献报道中多是针对黑茶样品中的优势菌株进行分离、鉴定，发酵条件和发酵产物方面研究，对于非优势菌及其发酵过程中微生物群落结构和动态变化研究却不甚清楚，以整体思维统筹微生物在黑茶发酵过程中品质变化的影响，对于优化黑茶生产条件和工艺具有重要意义。基于上述，我们收集相关黑茶文献，对黑茶发酵过程中微生物多样性及群落变化情况进行综述，探讨微生物对黑茶风味等品质形成的影响，为黑茶中益生菌的有效利用和更好开发黑茶资源提供参考。

1 黑茶发酵工艺与微生物

黑茶发酵与微生物存在密切的联系，在黑茶加工发酵储存过程中都有微生物参与，微生物分泌多种胞外酶进行酶促反应，水解转化多种有机物质，微生物作用形成了黑茶独特的风味特征(图1)。微生物遍布黑茶加工的各个工艺阶段，渥堆处理是黑茶品质形成的关键步骤，渥堆的实质是茶原料在一系列微生物的作用下，经过酶促反应和发酵过程，形成叶色黑润、香气纯正的品质特征过程[8]。

图 1 黑茶渥堆作用示意图

张亚等认为渥堆的实质是湿热环境、微生物作用和酶促反应三者综合作用的结果[8]。黑茶因此被认为是中国最特殊的一类微生物发酵茶。

黑茶发酵各个阶段过程中的优势菌不尽相同，优势菌和非优势菌共同组成了某一阶段中特有的微生物群落结构，对发酵进程起着各自不同的功能和作用，也使不同的阶段呈现不同的特点[9]。酵母菌、霉菌和细菌是黑茶发酵过程中的主要微生物群落，温琼英等研究表明，渥堆可分为渥堆前期和后期，黑茶渥堆过程中优势微生物种群是假丝酵母属(Candidaspp.)中的种群，黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉属(Penicillium)及少数霉菌，初期还有大量细菌，主要是无芽苞短杆菌(Bacillussubtilis)、芽孢细菌和球菌等[10]。对康砖茶的研究结果表明，细菌、霉菌、酵母依次在渥堆前期、中期、后期大量繁殖，由于渥堆环境的温湿度以及微生物种群对营养物质的需求不同，有的微生物适应环境，有的则受到抑制，因此各种群繁殖的时期也不尽相同[11]。以上大量的研究均表明，黑茶渥堆过程中微生物的变化存在一定的规律。

各微生物优势菌在微生物发酵过程中起到的作用不尽相同。酵母菌含有非常丰富的酶系统，蛋白质等有机物经酵母菌发酵后生物活性会大幅提高，还能利用多种糖类代谢产生维生素B1、B2、C等[12]；根霉发酵能够产生乳酸，有利于促进黑茶醇厚品质口感形成。黑曲霉能分泌多种水解酶，通过影响氨基酸的含量影响黑茶口感；产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)代谢产生的青霉素对杂菌、腐败菌可能有良好的抑制生长或消除作用[13]。冠突散囊菌产生各种胞外酶，抗氧化能力强，茶叶中各种大分子物质通过胞外酶酶促反应催化转化为可供利用的生物小分子，如冠突散囊菌产生的红冠突素和紫冠突素，经多酚氧化酶作用将茶多酚分解为茶黄素、茶红素乃至茶褐素，赋予了茶汤独特的红褐底色，提高茶叶风味[14]。

众多的研究表明，微生物与黑茶发酵过程密切相关，微生物的参与在黑茶发酵过程中起到了决定性的作用，在多种微生物菌株的作用下，成品黑茶茶汤具有独特的醇厚口感，并且还具有多种对人体有益的成分，引起国内外专家的广泛关注，黑茶也成为追求健康人士喜爱的产品。因此，加强黑茶发酵过程中微生物多样性研究，了解黑茶品质变化过程显得十分必要。

2 黑茶发酵与细菌多样性

黑茶发酵最重要的渥堆过程中，先后出现的微生物类群有细菌，以球菌和芽孢杆菌(bacillaceae)为主、真菌多为青霉、黑曲霉和酵母菌。随着渥堆时间的延长在种群和数量上不断发生变化[10]。

细菌是喜湿性不耐高温微生物，在渥堆前期，茶原料揉捻叶的含水量比较高，渥堆堆温也接近常温，这一条件刚好满足细菌类喜湿的要求，使之得以大量繁殖，是初期微生物群落的主要优势菌群。细菌数量骤增后，其呼吸强度加大，渥堆叶温迅速升高，同时，通过细菌的水解作用，为霉菌的生长累积了丰富的呼吸基质。当温度升高后，细菌由于耐温性较差，繁殖速度下降，数量呈现稳中有降的趋势。细菌前期的生理活动给以黑曲霉为主的喜温喜湿的霉菌创造了有利的生长发育条件。

细菌在初期生长阶段生长所需的碳源和氮源物质，主要靠分解茶原料中的水溶性物质如水溶性糖类、蛋白质、氨基酸和一些有机质获得[15-16]。对于水溶性糖类的利用方面，细菌只能将单糖消化分解释放出能量，而对双糖和多糖的利用最终还是要转变为单糖才能降解，细菌通过水解酶或者磷酸化酶将双糖分解为单糖[17]。细菌通过酶将蛋白质分解成氨基酸，主要通过脱羧、脱氨和转氨3种方式分解氨基酸，细菌分解氨基酸的能力较弱，氨基酸并不是细菌微生物获得营养物质的首要来源，获取营养物质的主要来源是以糖类和一些水溶性的有机质为主。但是由于细菌体内的许多与生命相关的蛋白质都是由氨基酸组成的，所以有关氨基酸合成方面的生理生化作用是细菌生命周期中不可替代的环节。茶原料中的其他水溶性的有机物主要是芳香类物质，细菌对芳香族化合物的分解是在有氧条件下生成环裂解产物进行，最终被分解成水和二氧化碳，并放出能量。

3 黑茶发酵与真菌多样性

真菌在黑茶发酵中的优势菌以霉菌和酵母为主，通常在中后期繁殖迅速，数量呈现稳定增加的趋势[18]。曲霉菌(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)在多种黑茶中都有发现，存在于黑茶加工的各个环节，是黑茶生产加工中不可或缺的重要微生物(表1)。胥伟等的研究表明散囊菌属、青霉属和曲霉属是微生物中的优势群落[19]，青霉在渥堆过程中能够水解茶叶中的纤维，增加糖类的含量，有助于形成黑茶醇和的口感。黑曲霉和酵母菌被证明是普洱茶中的优势菌，黑曲霉在渥堆时作为优势菌种，产生多种水解酶参与茶叶中各种物质之间的相互转化反应，其次是酵母菌。

表 1 黑茶中真菌的发生情况

冠突散囊菌是茯砖茶中的优势益生菌，温琼英在以淀粉、单宁、葡萄糖为碳源的琼脂培养基上接种冠突散囊菌，成功证明该菌能分解转化淀粉和单宁物质，降低茶叶的苦涩味，使茶叶滋味醇厚[25]。胡治远等对不同地区具有代表性的茯砖茶样品中的冠突散囊菌进行比较和鉴定，为冠突散囊菌多样性鉴定与不同生理小种的命名提供了基础[26]。

酵母菌是耐高温干燥真菌，与喜好常温湿润环境的霉菌和细菌相反，在渥堆中后期，由于堆温上升，酸度湿度改变，酵母菌数量开始占据主导地位，渥堆温度的变化极大改变了发酵微生物的群落组成和多样性状况，对黑茶品质的形成有重要影响。酵母菌通过酶促反应能够增加茶多酚、儿茶素和茶黄素等风味物质的含量，对黑茶香气浓郁醇和等品质特点形成，对各种功能性成分具有重要的调控作用[12]。

综上所述，在黑茶渥堆过程中，细菌、霉菌和酵母菌均起着非常重要的作用，而且不同种类微生物的更迭是其内部相互作用和自身代谢的必然结果。

4 黑茶与其他发酵茶微生物多样性

黑茶的产区分布十分广泛，各类黑茶制备工艺不尽相同，杀青、揉捻、渥堆、干燥是黑茶初加工过程中的必要工序(表2)。各类黑茶制备工艺中参与的微生物种类也不相同，但各类微生物都在某个进程中发挥特有的作用，对黑茶独特品质的形成发挥重要功效。

表2 各主要黑茶品种加工工艺

普洱茶渥堆过程中的优势菌种是以曲霉为主的霉菌和以产生酒精和产酯等生香酵母(Aromayeast)为主的酵母菌[20]，黑曲霉能水解蛋白质，通过改变氨基酸含量从而影响普洱茶的风味和品质，酵母菌在普洱茶加工发酵中的数量巨大，在普洱茶渥堆发酵的过程中对普洱茶的品质形成有重要作用，能够增加茶多酚和氨基酸的含量，减少黄酮、儿茶素和茶红素等降低茶品质的物质含量。

茯砖茶是所有黑茶品种中制备工艺流程最复杂的一种，在渥堆中主要参与的微生物有冠突散囊菌属(Crytospora)、散囊菌属、黑曲霉、毛霉(Mucoraceae)、青霉属、谢瓦氏曲霉(AspergillusSheva)、冠突曲霉(Aspergilluscristatus)[27]等。发花工艺是茯砖茶区别其他黑茶品质的关键工艺，起关键作用的是冠突散囊菌等散囊菌属真菌，冠突散囊菌等优势益生菌对黑茶独有菌花香的形成具有重要作用。

六堡茶渥堆过程中主要微生物有青霉、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、黑曲霉、黄曲霉(Aspergillusflavus)，在后发酵阶段也有少量金黄色散囊菌(GoldenSphaeroides)出现[23]，六堡茶独特风味的形成主要是通过霉菌实现的，其中曲霉、青霉在其中有促进变色作用，发酵后期出现的少量金黄色散囊菌能产生淀粉酶、氧化酶，对酶促反应进程具有一定影响。四川康砖茶中的细菌优势菌为葡萄球菌属(Staphyloccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)；假丝酵母属为酵母菌中的主要优势菌；霉菌优势菌则依次为黑曲霉属、青霉属、灰绿霉属、毛霉属，康砖茶中还发现了放线菌属(Actinomyces)以及耐高温的葡萄球菌属微生物[19]。

5 微生物对黑茶风味等品质的影响

黑茶生产的各个环节都有微生物参与，渥堆微生物对黑茶风味品质有重要影响，茯砖茶中的优势益生菌冠突散囊菌，在砖茶中生长，产生胞外酶和金花，同时能分解淀粉和单宁等物质，转化各种有机物质降低茶的苦涩味，使茯砖茶滋味醇厚，汤色红亮。黑茶中的香气部分来自微生物和其产生的胞外酶，在渥堆发酵过程中对底物作用产生的风味香气。曲霉分泌的铜酶络氨酸酶等胞外酶可以形成生物碱和激素，增加茶堆中苦味的嘌呤碱含量，和儿茶素苦涩味的减少，给黑茶的风味和滋味品质带来了巨大的影响[28]。细菌和真菌的存在，降解了粗纤维，导致了茶色褐黑，滋味变醇和，但细菌数量过多反而会影响黑茶的品质。根霉能够产生乳酸，有利于促进黑茶醇厚品质口感形成。黑曲霉能分泌多种水解酶，通过影响氨基酸的含量影响黑茶口感。微生物分离培养结合气相色谱、分光光度法、质谱法等多种方法应用于黑茶色泽、香气、滋味等风味研究，使对黑茶品质形成的研究更加深入。

6 展望

黑茶作为中国最特殊的一类微生物发酵茶，由于独特的口感和多种保健功效，受到民众欢迎和追捧。结合现有文献资料，对黑茶今后发展提出了几点展望：1)从黑茶优势菌“金花菌”发现至今，对其分类地位一直存在争议，借助现代分子技术和手段，明确其分类地位和种系发生，同时加大对非优势菌的研究，加强优势菌与非优势菌组合研究，对于改良黑茶加工工艺，缩短发花和渥堆时间均有借鉴意义。2)微生物的生长发育和类群演替受环境条件因子的影响较大。渥堆叶含水量很大程度上决定了微生物的繁殖速度及菌群分布，进而影响叶温和酸度的变化，因此加强黑茶渥堆机械化控制技术的研究将是黑茶研究的一大趋势。3)黑茶由于是一类较为特殊的微生物发酵茶，除通常的营养价值外，还具有一些突出的保健功能，黑茶市场因此变得更加广泛，除早年产黑茶可以作为藏品进入收藏市场，黑茶原料经不同微生物发酵后进行深加工可制成发酵食品如减肥茶和面膜等日用品，添加优势菌菌悬液进行液体发酵快速生产有助于提高产量，加强黑茶深加工研究也是今后研究的一大热点。4)从国际最大茶叶品牌，立顿红茶的发展经验来看，坚持品质、确保稳定的质量标准，按照统一的生产标准，将不同产地不同品种的黑茶种类按照统一标准生产制造、联合销售，形成国际知名的大品牌，改善现在茶叶地域各自为战，产量小，地域性强，小作坊式生产格局，对于当前破解全国黑茶产业发展困局也有借鉴意义。