水稻硝态氮响应的酵母双杂交文库的构建与分析

洪广成, 陈 倩, 刘石锋, 张汉马, 秦小健

(重庆师范大学 生命科学学院 植物环境适应分子生物学市重点实验室， 重庆 401331)

酵母双杂交技术是Fields等首先创立的，是目前研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的主要方法[1-3]。其原理是利用酵母特异转录激活因子GAL4(galactose-regulated upstream promoter element, GAL )具有DNA 特异结合域( DNA-binding domain )与转录激活结构域( transcription-activating domain )两个彼此分离的结构域，两个结构域之间相互独立互不影响，但只有同时含有这两个结构域时才能转录激活特定的表达基因，具有高效、简便、高灵敏度等优点[4-7]。

水稻作为我国三分之二人口的主食，水稻产量的稳定与增收对于整个社会的稳定发展具有重要意义[8]。在过去的几十年中，人工合成氮肥的出现极大地提高了水稻的产量[9]。但由于过量施肥和不科学的施肥方式导致了水体富营养化、环境污染和温室效应等一系列生态问题的出现。因此在农业实际生产中, 大量施加的氮肥若不能被水稻高效吸收利用, 造成的资源损失和环境负面影响要比实际收益大得多[10-13]。

目前水稻产量受技术和养分的限制已到达瓶颈，需要从基因和其他方向做突破[14-15]。为了研究硝态氮响应条件下的相关水稻基因调控机理，本研究构建了水稻氮响应cDNA文库，为后续研究提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 籼型杂交稻恢复系“9311”系中籼水稻品种(OryzasativaL.spp.indicavar.9311)。

1.1.2 主要试剂 “Mate & Plate”文库构建试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 购自Clontech 公司；质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；TRIzol®Reagent 购自Life Technologies 公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的培养与处理

用改良后不含氮素的霍格兰营养液水培，以KNO3作为唯一氮源，在培养箱内先将已催芽的水稻种子放置于低氮(0.3 mmol/L)条件下培养15 d，再将其迅速转移至高氮(5 mmol/L)水平条件下培养4 h后迅速提取处理材料的总RNA以备后用。

1.2.2 水稻总RNA的提取与检测

将已处理的水稻组织放入加有液氮的研钵中研磨至粉状，用Trizol提取法提取水稻的总RNA，具体步骤可参考Trizol试剂说明书。试验所用的研钵经酒精灼烧，所用离心管、枪头等均经过RNase free处理过，样品摆放在冰面上，全程在超净工作台上操作，离心采用低温离心机，防止提取过程中总RNA发生降解，最后将分离纯化得到的总RNA用30 μL的DEPC水溶解。用BioDrop分光光度计测RNA浓度，并用浓度为 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 质量。

1.2.3 RNA反转录cDNA与检测

建立反转录体系合成第一链 cDNA，以提取的水稻总RNA作为模板，CDS III(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3′)为引物。再以合成的第一链cDNA为模板，使用长距离 PCR (LD-PCR) 扩增 ds cDNA。用CHROMA SPIN+TE-400 纯化柱纯化扩增的 ds cDNA，除去200 bp以下的小片段，具体步骤参考说明书 PT4085-1(Clontech)。用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的ds cDNA。

1.2.4 Y187酵母感受态制作

挑取划线平板上生长最快的Y187酵母单克隆菌株用YPDA培养液扩大培养，并用分光光度计检测菌液的OD600值，达到浓度后用1.1×TE/LiAc溶液制备建库所需的感受态酵母，具体操作步骤参考说明书 PT4085-1(Clontech)。

1.2.5 构建cDNA文库

用DMSO增强感受态酵母的细胞通透性，以高温变性后迅速低温处理的单链鲑鱼DNA为携带载体，用热激法将质粒载体pGBKT7-Rec和纯化处理的双链cDNA 共同转入感受态酵母细胞。用YPD Plus Medium恢复处理转化的酵母细胞后，再用15 mL 0.9%(W/V) NaCl溶液悬浮菌液，涂布于SD/-Leu培养基上，30℃倒置培养3 d后，用玻璃珠和冷冻液收集菌体，得到的酵母菌悬浮液即为构建的酵母双杂交cDNA文库；将菌液分装在1.5 mL无菌离心管中，-80℃低温保存，详细步骤参照说明书 PT4085-1(Clontech)。

1.2.6 cDNA文库转化率及文库大小的测定

从 15 mL 0.9% (W/V) NaCl 菌悬液中吸取100 μL菌液，稀释10倍、100倍后分别吸取100 μL稀释后的菌液涂布于 SD/-Leu 培养基上 30℃倒置培养 3 d，统计培养基上的单克隆菌落数计算转化效率。取10 μL收集在冷冻液中的菌液稀释102、104和106倍后，分别吸取100 μL涂布于SD/-Leu 培养基上30℃倒置培养3 d，统计平板上的单克隆菌落数计算文库滴度。

1.2.7 cDNA文库平均插入片段大小及重组率的计算

从计算转化效率的SD/-Leu 培养基上随机挑选20个单菌落扩大培养，提取酵母质粒DNA。以提取的质粒DNA为模板，pGADT7-Rec载体上游引物 Primer： 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCA-3′，下游引物 Primer：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′进行PCR 扩增。扩增程序：95℃预变性3 min； 95℃变性 30 s， 58℃退火 30 s， 72℃延伸 3 min，30个循环； 72℃再延伸10 min； 最后12℃保存。反应结束后用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。

1.2.8 cDNA文库平均插入片段的分析

从计算文库滴度的培养基中随机挑选10个单克隆，提取质粒后测序，并在NCBI上用Blast 功能对测序结果进行序列比对，寻找匹配序列。

2 结果与分析

2.1 总RNA 的提取

用Trizol提取法提取处理过的水稻材料9311的总RNA。将提取后的总RNA用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S及18S条带清晰，5S条带较弱(图1)，RNA的完整性较好。经过分光光度计检测，浓度约 2 μg/μL ，表明 RNA的质量较好，可用于下一步文库的构建。

2.2 cDNA的合成与文库的构建

取 2 μL 提取的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，再以合成的第一链cDNA为模板，用LD-PCR体系扩增出ds cDNA，经浓度1% 琼脂糖凝胶电泳检测显示，ds cDNA的电泳条带呈弥散状，大小集中分布在 500～3000 bp 范围内(图2)。将合成的ds cDNA与载体pGADT7-Rec混合共转化到感受态酵母菌Y187中得到cDNA文库。 收集cDNA文库的菌体，使用1.5 mL无菌离心管每管分装1 mL后存放于-80℃备用。

图1 总RNA电泳检测

Figure 1 The electrophoresis of total RNA detection

图2 ds cDNA 电泳检测

Figure 2 The electrophoresis of total ds cDNA detection

图3 计算文库转化效率SD/-Leu 培养基

2.3 cDNA 文库的转化效率及插入片段大小检测

文库转化完成后加入 15 mL 0.9% (W/V) NaCl溶液悬浮菌液，吸取10 μL悬浮后的菌液稀释100倍涂布于SD/-Leu 培养基上，30℃恒温箱倒置培养3 d(图3)。统计平板上的克隆数共215个，转化效率计算公式：平板上的单克隆数×稀释倍数×总转化混合物体积/涂布体积 /3 μg pGADT7-Rec,计算得到转换率为3.23×106/3 μg pGADT7-Rec满足实验需要的1×106/3 μg pGADT7-Rec。将收集在冷冻液中的 cDNA 文库混合均匀，吸取 10 μL菌液稀释100倍，再取10 μL稀释后的菌液稀释100倍，最后取10 μL稀释两次后的菌液稀释100倍得到3种不同浓度的文库，即原浓度的10-2、10-4和10-6。分别取100 μL稀释后的文库涂布于SD/-Leu 培养基上，30℃恒温箱倒置培养3 d(图4)。在稀释至10-6的平板上平均长出17个单克隆菌落，文库滴度(CFU/mL)= 单平板平均菌落数(17)/ 涂布体积(0.1 mL)×稀释倍数(106)=1.7×108cfu/mL，满足实验所需滴度 2×107cfu/mL。从转化效率的平板上随机挑取20个单菌落进行 PCR 检测只有1个未能扩增出相应的片段(图5)，重组率达 95%； 插入片段长度介于500 ～1500 bp 之间，平均插入片段长度在1000 bp左右，文库质量较好，可用于后续互作蛋白的筛选。

A、B、C：稀释至10-2、10-4和10-6后的酵母菌悬液分别在文库 SD/-Leu 平板上的生长情况，用于计算文库滴度

图4 不同浓度的 cDNA 文库在 SD/-Leu 培养基上的生长情况

Figure 4 The growth of different concentrations cDNA library yeast on SD/-Leu medium

图5 cDNA 文库插入片段大小电泳检测

2.4 cDNA 文库插入片段分析

从文库中随机挑选10个克隆测序后，通过NCBI上Blast序列比对分析，共有9个克隆匹配到同源序列(表1)。其中除了2、6插入片段在序列比对时有部分碱基匹配错误，其他插入片段编码顺序均较匹配。

3 讨论与结论

cDNA文库的质量取决于文库的代表性与完整性[16-17]，而完整性的体现需要总RNA的高质量提取，在提取过程中几乎未发生RNA的降解，并且RNA高度纯化无杂质。本试验所用的总RNA经过纯化处理后的电泳图片28S和18S条带清晰，表明总RNA的质量较高，可用于文库的构建。

表1 测序匹配基因信息统计

本试验使用的是Clontech 公司“Mate & Plate”文库构建系统构建的水稻 cDNA文库。用 SMART 技术合成的 ds cDNA 不需要对总RNA中的mRNA进行分离纯化，因而避免了mRNA的降解损失；反转的ds cDNA再通过 CHROMA SPIN TE-400 柱子的纯化，去除小片段DNA，减少cDNA文库在整合外源片段时产生的不利因素。同时利用同源重组的方法将与 pGADT7-Rec 载体末端同源的ds cDNA 定向重组到pGADT7-Rec 载体上，不仅可以有效避免繁琐的酶切连接等步骤，同时也解决了连接的低效性和克隆的嵌合问题，从而保证了cDNA 文库整合外源 ds cDNA 时的方向性和完整性[18]。通过转化效率检测的结果达到3.23×106/3 μg pGADT7-Rec满足实验所需条件，保证了试验文库的完整性和代表性。文库的插入片段大小在1500 bp以下，说明大片段cDNA在同源重组时的效率较低，为以后的文库构建提供经验。

本试验构建的水稻9311氮响应条件下的cDNA酵母文库，cDNA文库滴度1.7×108cfu/mL，插入的片段大小在500～1500 bp之间，文库的质量符合筛选条件，可用于后续水稻氮吸收与利用关键基因互作蛋白筛选，为水稻氮素利用分子调控通路关键基因的挖掘提供帮助。