苦瓜白粉病的生物防治及病程代谢物质含量变化

周 游 汪 军 杨腊英 郭立佳 梁昌聪 刘 磊 黄俊生

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南海口 571101）

苦瓜白粉病主要由单丝壳白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）引起，叶片正面或者背面在发病初期形成白色粉斑，随着病情发展，病斑连成片，并逐渐褪绿变黄直至变褐干枯，叶片光合作用降低，最终引起植株衰弱死亡，缩短采收期。该病在苦瓜整个生育期均可发生，尤其在高温高湿条件下发生最为严重（陈燕琼，2010）。目前生产上主要使用化学农药进行防治（魏林 等，2016），随着全社会对环境安全及食品品质要求的不断提高，化学农药减量使用、高效生物药剂作为化学农药的替代产品正受到越来越多的重视，有益微生物防治植物病害获得长足进展，其中芽孢杆菌是一类应用广泛的生防微生物，能有效防治多种植物病害（Chen et al.，2009；Shrestha et al.，2016；Xu et al.，2016）， 其主要的防病机制为营养竞争，产生拮抗物质，寄生和诱导植物抗性等（黄曦 等，2010；Beneduzi et al.，2012）。

前人研究表明，芽孢杆菌作用于植物后能引起植物防御酶、脯氨酸和丙二醛等物质的改变，而这些改变被视为是芽孢杆菌诱导植物产生抗病性的原因（Chandrasekaran & Chun，2016；Elanchezhiyan et al.，2018）。但是，不仅仅是芽孢杆菌能诱导植物产生抗病性，病原菌侵染寄主植物后也能产生类似效应。例如，梨叶片和苹果枝条被病原菌侵染后水杨酸和木质素的含量明显提高，由此增强了梨和苹果对病原菌的抗性（张海娥 等，2014；刘斐 等，2015）。抗白粉病的苦瓜品种感染白粉病后，通过提高叶绿素、抗坏血酸和可溶性糖含量以及增强过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性来提高抗病性，这些变化的物质是评价苦瓜白粉病抗性的最佳指标（田丽波 等，2015）。目前，针对某些抗性相关酶，例如超氧化物歧化酶（SOD）、POD和PPO等，以及茉莉酸、水杨酸、绿原酸和丙二醛等物质在植物与生防菌或病原菌作用过程中的变化情况已有大量报道，但是鲜见从代谢组层面研究苦瓜感染白粉病后代谢物质含量的变化情况。代谢物的变化可视为生物体对外界环境变化的应答，对代谢物的分析能够探明特定条件下的生物细胞状态（Zushi & Matsuzoe，2015；Eloh et al.，2016）。

有鉴于此，本试验采用枯草芽孢杆菌BLG010作为生防菌株，探明其对苦瓜白粉病的防治效果。同时，通过分析苦瓜感染白粉病后代谢物质含量的变化，发现了3种有机酸、2种氨基酸和2种糖类物质的含量变化与苦瓜白粉病病程相关，为苦瓜抗白粉病品种筛选提供了线索，也为苦瓜白粉病防治策略提供了有力的科学支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

生防菌株：枯草芽孢杆菌BLG010（专利号：CN102747020A）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5953。将菌株在LB平板上活化培养，将活化后的菌体接入含LB液体培养基的三角瓶中，37 ℃、180 r·min-1黑暗培养。2 d后，将培养液分装在50 mL离心管中，8 000 r·min-1离心5 min，倒去液体；加入40 mL无菌蒸馏水，并剧烈振荡离心管使管底的菌体分散，再次8 000 r·min-1离心5 min，倒去液体，该过程重复3次；用无菌药品勺将离心管底部菌体挖出，用无菌蒸馏水稀释成浓度为1×108个·mL-1的孢子悬浮液。

苦瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）：自然菌株，采集于海南省琼中县湾岭镇鸭坡村自然发生白粉病的苦瓜叶片。用无菌毛笔在发病叶片上来回涂抹后，将毛笔放入装有无菌蒸馏水的灭菌瓶中，来回振荡冲洗毛笔上的孢子，获得高浓度的孢子悬浮液，用无菌纱布过滤带有孢子的蒸馏水以便滤掉杂质，利用血球计数板在显微镜（ECLIPSE 80i，尼康，日本）下计数过滤后的蒸馏水中的分生孢子数，用无菌蒸馏水作为稀释液将高浓度的孢子悬浮液制备成1×106个·mL-1的孢子悬浮液。

苦瓜品种为中华1号，购自海南根果多农业科技有限公司。

1.2 处理方式

选取外观饱满无瑕疵的无病苦瓜种子，用无菌蒸馏水浸种催芽后于2018年1月5日种植于装有灭菌土的花盆中，每盆1株，将种苗放置于本所实验楼楼顶大棚里培养（位于海口市龙华区），将每8个花盆分为一组。于2018年2月9日，当苦瓜植株长至20 cm时进行以下3个处理，每株喷35 mL，不同处理间距离7 m并用透明塑料薄膜隔离培养，每个处理3次重复，每个重复含8株苦瓜苗。

① 白粉病菌处理：在18：00后无太阳光直射时，将白粉病菌孢子悬浮液喷施于苦瓜叶片上。

② 白粉病菌+BLG010处理：在18：00后无太阳光直射时，将白粉病菌孢子悬浮液喷施于苦瓜叶片上，2 d后在同一时间段喷施BLG010孢子悬浮液。

③ 蒸馏水对照（CK）：在18：00后无太阳光直射时，将无菌蒸馏水喷施于苦瓜叶片上。

1.3 不同处理的代谢物质GC-MS分析

分别于接种处理后8、15 d时采集3个处理的叶片，每株幼苗均采集从下往上数的第4片真叶，用于代谢组检测，每8个叶片作为1个重复。

① 代谢物质的提取：将苦瓜叶片在液氮中快速冷冻研磨，利用甲醇和氯仿提取代谢物，以核糖醇（0.2 mg·mL-1）作为内标，将提取液进行真空冷冻干燥。

② 衍生化：在提取物中加入40 μL 甲氧基胺基盐酸盐吡啶溶液（吡啶含量为20 mg·mL-1），37℃、250 r·min-1摇晃 2 h，加入 70 μL N，O- 双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含1% 三甲基氯硅烷），70 ℃、250 r·min-1振荡60 min，取出样品室温放置30 min，过0.22 μm有机滤膜。

③ 色谱条件：Thermo TRACE1310/ ISQ™ QD GC-MS，毛细管色谱柱为Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样量 1 μL，不分流进样。载气为高纯氦气，1.0 mL·min-1，恒流模式。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，以5 ℃·min-1的速度升至300 ℃，维持1 min。进样口温度设定为 250 ℃。

④ 质谱条件：EI离子源，温度250 ℃，电子轰击电压为70 eV。质谱检测范围为45～600（m/z）。每0.2 s扫描一次，溶剂延迟3 min。样品采用随机顺序连续自动进样。

⑤ 数据处理：对样品的总离子图进行色谱峰识别，并与NIST质谱数据库比对，鉴定代谢物质的种类，使用自动积分方法进行积分，再对自动积分结果进行手动校正，对代谢产物进行定性和相对定量分析。

1.4 苦瓜白粉病病情调查和防治效果评价

接种15 d后按田丽波等（2015）的分级方法记录发病情况，并计算病情指数和防治效果。

苦瓜白粉病病情分级标准：0级，无病斑；1级，少量细小模糊的白粉斑，病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级，白粉层薄，病斑面积占整个叶面积的6%～10%；5级，白粉层较厚，病斑面积占整个叶面积的11%～20%；7级，白粉层厚，病斑面积占整个叶面积的21%～40%；9级：白粉层厚，病斑面积占整个叶面积的40%以上。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌BLG010对白粉病的防治效果

试验结果表明（表1），仅接种白粉病菌的处理白粉病发生严重，接种15 d后病情指数高达57.16。接种白粉病菌后再喷施枯草芽孢杆菌BLG010的处理白粉病发生轻微，病情指数为6.01。喷施蒸馏水的处理未见白粉病发生。BLG010对白粉病的防治效果高达89.49%。

表1 枯草芽孢杆菌BLG010对苦瓜白粉病防治效果

图1 苦瓜代谢物质GC-MS总离子流色谱图

2.2 苦瓜代谢物质含量变化分析

各处理的GC-MS 总离子流色谱图峰形较好（图1），可通过峰面积计算相对含量，通过NIST标准谱库确认化学结构。经计算后得知，甘油酸（glyceric acid）、延胡索酸（fumaric acid）、咖啡酸（caffeic acid）、甘氨酸（glycine）、L-谷氨酸（L-glutamic acid）、D-葡萄糖（D-glucose）和肌醇半乳糖苷（galactinol）这7种物质的相对含量在不同处理间呈现规律性的差异（图2、3、4）。在接种处理后8 d和15 d两个时间点，与白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照相比，白粉病菌处理的D-葡萄糖、肌醇半乳糖苷和延胡索酸含量均上调表达，而甘氨酸、L-谷氨酸、甘油酸和咖啡酸则表现为下调。

上述7种物质中，在接种后8 d时肌醇半乳糖苷和延胡索酸分别是3个处理含量最高和最低的代谢物质；在15 d时，3个处理含量最高的代谢物质依然是肌醇半乳糖苷，而延胡索酸是白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照含量最低的代谢物质，甘氨酸则为白粉病菌处理含量最低的代谢物质。从代谢物质含量变化程度分析可知，8 d时，白粉病菌处理的D-葡萄糖含量分别是白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照的6.499倍和2.695倍；15 d时，白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照的甘氨酸含量分别是白粉病菌处理的6.291倍和6.316倍；说明D-葡萄糖和甘氨酸分别是8 d和15 d时白粉病菌处理与另外2个处理间含量变化程度最大的代谢物质（图2、3）。试验结果也表明，BLG010可以避免这7种代谢物质含量的异常变化。

图2 糖类物质在3个处理间的变化

图3 氨基酸在3个处理间的变化

图4 有机酸在3个处理间的变化

3 结论与讨论

植物在不同的生存条件下其代谢物质的含量会发生改变，所以研究不同处理条件下的代谢组能探明植物响应外界条件的特征物质。本试验对白粉病菌、白粉病菌+BLG010和蒸馏水3个处理的苦瓜叶片进行代谢组检测，结果发现，3种有机酸、2种氨基酸和2种糖类物质的含量在不同处理间呈现规律性的差异。其中D-葡萄糖和甘氨酸分别是接种后8 d和15 d白粉病菌处理与另外2个处理间含量变化程度最大的代谢物质。

葡萄糖参与光合作用、氮代谢和胁迫响应等生物过程，不仅是植物生理活动的能源物质，也可作为信号分子参与植物生长发育过程的调控（苗慧莹等，2012；郜明泉 等，2015）。葡萄糖主要由蔗糖转化酶（invertase，Inv）将蔗糖水解生成（罗玉，2004），在植物被微生物侵入后会产生积累现象（邹英宁 等，2014；朱艳蕾和米丽吾叶提·阿达力，2018）。吴越（2014）的研究表明，甜橙感染黄龙病后出现Inv活性增加和可溶性糖累积的情况，认为Inv活性增加是导致葡萄糖大量积累的主要原因。本试验中，白粉病菌处理的叶片中D-葡萄糖含量显著高于白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照，这可能是由于苦瓜受到白粉病菌侵染后通过调控相关酶，提高了合成葡萄糖的速度，而高含量的D-葡萄糖可作为渗透调节物质降低白粉病菌的侵害程度。这与刘业霞等（2011）和杨志晓等（2015）的研究结果类似，他们认为植物受到病原菌侵染后可溶性糖含量会增加，由此加强渗透调节能力来抵抗病原菌的胁迫。

甘氨酸是由乙醛酸在转氨酶作用下得到氨基生成，在光呼吸途径中起着重要的作用（郭玉朋，2014；刘美君，2016）。甘氨酸可由丝氨酸羟甲基转移酶转变成丝氨酸，为生物合成反应提供一碳（C1）单位（马莉和陈丽梅，2008），而丝氨酸含量的变化能影响光呼吸基因的表达节律（韩晓芳等，2016）。甘氨酸也能生成甘氨酸甜菜碱，而甘氨酸甜菜碱在植物受到外界胁迫时在体内积累，由此提高植物对胁迫的耐受性（徐保红和杨洁，2008；刘春 等，2013）。有研究证明外施甘氨酸能提高植物对外界胁迫的抵抗力（孙弘 等，2010；仇奕之 等，2018）。本试验中，苦瓜感染白粉病后甘氨酸含量下降的可能原因是，白粉病菌侵染导致甘氨酸合成受阻，或者是苦瓜受到侵染后为了补偿光呼吸效率而过度消耗丝氨酸，从而使甘氨酸过量转化为丝氨酸，导致甘氨酸含量下降，亦或者是苦瓜大量消耗甘氨酸用于甘氨酸甜菜碱的累积，由此来提高对白粉病菌的耐受性。

本试验也发现，苦瓜被白粉病菌侵染后，体内L-谷氨酸和咖啡酸含量下降。谷氨酸是植物体内重要的氨基酸，不仅是多数氨基酸的合成前体，也是叶绿素合成的起始物质（江胜德 等，2015），同时也是γ-氨基丁酸、脯氨酸、精氨酸和鸟氨酸等与植物抗逆性相关物质的合成前体（Yang et al.，2017）。谷氨酸可分为L-谷氨酸、D-谷氨酸和DL-谷氨酸，其中具有重要生物学意义的是L-谷氨酸（杨佳丽，2017）。Santos等（2002）报道，向日葵在盐胁迫下会通过降低脯氨酸氧化酶（proline oxidase）活性和提高吡咯啉-5-羧酸还原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase）与鸟氨酸转氨酶（ornithine aminotransferase）活性来提高脯氨酸含量，并且通过提高谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）活性来降低谷氨酸含量，他们认为吡咯啉-5-羧酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的提高是谷氨酸含量降低的主要原因。本试验中，白粉病菌处理的L-谷氨酸含量在接种后8 d和15 d两个时间点均比白粉病菌+BLG010处理和蒸馏水对照低，可能的原因是白粉病菌侵染苦瓜后，加大了用于抵御白粉病菌侵染的脯氨酸等抗逆性物质的合成，从而导致L-谷氨酸过量消耗。咖啡酸是羟基苯丙烯酸类化合物，由4-香豆酸在肉桂酸-3-羟化酶（C3H）的催化下形成，属于莽草酸途径（包伊凡 等，2018）。咖啡酸在咖啡酸-O-甲基转移酶（caffeic acid-O-methyltransferase）作用下生成阿魏酸，阿魏酸能抑制病原真菌的孢子萌发和菌丝生长，使植物发病速度得到抑制（贺军花，2018）。咖啡酸和阿魏酸也是植物木质素的合成前体，研究表明木质素是植物防御病原菌的重要物质（夏斐 等，2015；唐永萍 等，2017）。有研究报道，丹参和龙葵在非生物因子胁迫下会积累咖啡酸（邓小鹏，2010；刘晓蕾，2011），这与本试验的结果相反，可能的原因是植物应对生物胁迫与非生物胁迫的防御反应机制不同。本试验中，苦瓜叶片受到白粉病菌侵染后咖啡酸含量下降的原因可能是，苦瓜受到白粉病菌侵染后加大了咖啡酸向阿魏酸生成的速度，生成大量的阿魏酸用于抑制白粉病菌的生长，这与胡玉林等（2011）的研究结果类似，他们发现香蕉接种尖孢镰刀菌后，阿魏酸的含量表现为上调；另一个原因可能是苦瓜受到白粉病菌侵染后加大了咖啡酸向木质素转化的速度，使苦瓜叶片细胞的细胞壁快速变厚，由此抑制白粉病菌菌丝在叶片内扩展，这与韩园园等（2012）和张海娥等（2014）的报道类似，他们发现苹果和梨被病原菌侵染后，体内木质素的含量表现为上调；而无论是生成阿魏酸或者木质素均能引起咖啡酸含量的降低。

本试验首次利用气相色谱-质谱联用技术发现了D-葡萄糖、肌醇半乳糖苷、L-谷氨酸、甘氨酸、甘油酸、延胡索酸和咖啡酸等7种物质的含量变化与苦瓜白粉病病程相关，这为将来苦瓜白粉病抗病育种及防治提供了理论支撑。植物病害生物防治是生态友好型防治手段，能为农业的可持续发展提供保障。芽孢杆菌是目前广泛应用的生防菌，已经成功地用于防治黄瓜、番茄、南瓜等多种瓜果蔬菜病害。本试验采用的专利菌株—枯草芽孢杆菌BLG010对苦瓜白粉病的防治效果高达89.49%，为今后防治苦瓜白粉病生防菌株的选择提供了可用资源。