红花配方颗粒质量标准提高研究*

王晓伟，刘瑞新，石 岩

(1. 河南省食品药品检验所，河南 郑州 450008； 2.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州450000； 3.中国食品药品检定研究院，北京 100050)

红花为菊科红花属植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，是常用的活血化瘀中药材之一，适用于经闭、痛经、胸痹心痛、跌扑损伤、疮疡肿痛等证[1]。羟基红花黄色素A、山柰素、槲皮素等黄酮类成分是红花中的一类主要活性成分[2]。现行2015版《中国药典》一部红花药材质量标准，不仅检测了其羟基红花黄色素A的含量，也对其山柰素的含量进行了控制[3]。红花配方颗粒是由红花单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，具有免煎易服、携带方便等优点。已有文献[4]报道了红花配方颗粒的质量标准研究，但仅对羟基红花黄色素A含量进行了测定。为有效控制红花配方颗粒的质量，笔者以2015版《中国药典》一部中红花项下相关内容为依据，参考《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，建立薄层色谱法对红花配方颗粒进行定性鉴别，采用HPLC法对红花配方颗粒中的山柰素进行含量测定。

1 药品、试剂与仪器

红花配方颗粒共9批，来自X，F和W三家生产企业，具体见表1。山柰素对照品(纯度93.2%，批号110861-201310)、红花对照药材(批号120907-201713)，均购自中国食品药品检定研究院。甲醇，为色谱纯，德国Merck公司产品；水为超纯水；其他试剂为分析纯。硅胶G预制薄层色谱板购自青岛海洋化工厂和烟台市化学工业研究所。色谱柱Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。LC-20A高效液相色谱仪，SHIMADZU公司产品；SIGMA3-30ks高速台式冷冻离心机，Sigma-Aldrich公司产品； Digistore薄层色谱数码成像系统，CAMAG公司产品；XPE205电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；GZX-DH-400-BSII电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司产品；IKA C-MAG HP 7加热器，IKA公司产品；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司产品；KQ-300型超声波仪，江苏昆山市超声仪器有限公司产品。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 薄层特征鉴别

取本品1 g，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

另取红花对照药材2 g，加水50 mL，煮沸30 min，滤过，滤液浓缩至20 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，同法制成对照药材溶液。按《医疗机构中药煎药室管理规范》中药饮片煎煮方法相关操作规范规定，制备标准汤剂溶液。取红花饮片，称取红花饮片100 g，采用砂锅煎煮两次：第1次加水1 400 mL，浸泡30 min，先用武火煮沸再改用文火煎煮30 min；第2次加水1 000 mL，煎煮20 min。合并两次煎煮液，滤过，取滤液60 mL蒸干，同供试品制备方法，制成标准汤剂溶液。

吸取供试品及标准汤剂溶液各6 μL、红花对照药材溶液3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇(3∶7∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置紫外光灯(365 nm)下检视，结果见图1。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，且与标准汤剂色谱斑点保持一致。

1．红花对照药材； 2．供试品(批号04215101)； 3．标准汤剂图1 红花TLC鉴别图谱

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件的选择

色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-4 mL/L磷酸溶液(50∶50)为流动相，检测波长为367 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。理论板数按山柰素峰计算应不低于3 000。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液的制备：取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL含10 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液(15→37)5 mL,摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性样品溶液的制备：按处方比例称取辅料同法制成阴性样品，并按照供试品的处理方法制备缺红花的阴性样品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和缺红花阴性样品溶液各10 μL，进样。结果表明，阴性样品色谱中在与山柰素相应的保留时间没有色谱峰，表明辅料对山柰素的测定无干扰，以本法测定本品中山柰素的含量具有专属性，见图2。

A.供试品；B.对照品；C.阴性样品图2 供试品、对照品和阴性样品HPLC对比图

线性关系的考察：精密称取山柰素对照品6.16 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量超声处理使溶解，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量分数为114.822 4 mg/L的山柰素对照品贮备液；精密量取0.1，0.3，0.5，1，3，5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量分数分别为1.148 224，3.444 672，5.741 120，11.482 240，34.446 720，57.411 200 mg/L的对照品溶液；精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，进行测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=4 603 113.999 5X-8 444.818 2，r=0.999 99。结果表明：山柰素在0.011 48～0.574 11 μg范围内线性良好。

精密度试验：精密吸取同一供试品(批号04215101)溶液10 μL，重复连续进样6次，测精密度。结果：RSD为0.28%。

稳定性试验：取供试品(批号04215101)，研细，取约0.5 g，精密称定，按供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0，2，4，8，12，24 h进样测定。结果：RSD为0.24%。结果表明：供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取供试品(批号04215101)，按2.2.2项下方法分别制备6份，测定山柰素的含量。结果：平均含量为0.913 2 mg/g，RSD为0.33%。

加样回收试验：精密称取山柰素对照品5.05 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成质量分数为0.023 5 g/L对照品溶液。精密量取5，10，15 mL(各3份)，分别置具塞锥形瓶中。取样品(批号04215101)适量，研细，取约 0.25 g，精密称定，置上述具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20，15，10 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液(15→37)5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10 μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果见表2。

表2山柰素加样回收实验结果

n=9

色谱柱耐用性试验：分别使用3种不同品牌的色谱柱，即Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm) 、YMC-Pack ODS-A (250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)对同一批样品进行测定。结果：山柰素RSD为0.91%。结果表明：本法色谱柱耐用性良好。

样品含量测定：按2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定9批样品中山柰素的含量，结果见表3。

表39批样品山柰素含量测定结果

批号含量/(mg·g-1)042151010.913 2042151020.701 9042151030.767 4201807010.690 6201807020.737 1201807030.821 51805010.660 41805020.685 21805030.676 3

按2.1项下方法制备标准汤剂，按2015版《中国药典》一部红花项下山柰素含量测定方法，测定标准汤剂及其制备原料红花饮片的山柰素含量，结果见表4。

表4 标准汤剂含量测定结果

按2015版《中国药典》一部红花项下山柰素含量测定方法，测定X厂家所提供3批配方颗粒样品原料红花饮片的山柰素含量，并计算转移率，结果见表5。

表5 3批样品山柰素含量测定结果

3 讨 论

在研究薄层色谱鉴别方法时，考察了直接用800 mL/L丙酮提取的样品处理方法，但是这样处理后供试品色谱分离效果较差，而使用本文方法则能较好地去除拖尾，有效地提升了色谱分离效果。同时也考察了不喷三氯化铝试液，展开晾干后直接置紫外光灯(365 nm)下检视，但供试品谱中疑似羟基红花黄色素A黄色斑点没有出现，故仍采用喷以氯化铝试液，加热后置紫外光灯(365 nm)下检视的方法。供试品色谱中黄色斑点是否为羟基红花黄色素A，有待进一步确认。另外，在实验中，曾试用了不同厂家制备的硅胶G板，在不同的温度和相对湿度条件下展开，结果本文所建立的红花的鉴别方法鉴别特征清晰，对不同的层析条件耐用性较好，可作为样品中红花的定性鉴别方法。

在研究山柰素的含量测定方法时，分别考察了不同的提取溶剂(甲醇、800 mL/L甲醇水溶液、500 mL/L甲醇水溶液)、不同的提取方法(超声提取法、加热回流提取法、振摇提取法)、不同提取时间(15，30，45 min)，以及不同提取液与取样量比例(500，200，100，50，25倍)。最终，根据提取的效率与提取完全程度确定了文中的样品提取方法。

配方颗粒是以饮片为原料经水煎煮提取，浓缩，干燥并加适当辅料制成的颗粒，很好的解决了标准汤剂煎煮耗时且服用量大等问题，其临床应用日渐广泛[5]。然而由于不同厂家所选用饮片原料和生产工艺不同，一品多家的配方颗粒其内在质量差异也较大。笔者测定标准汤剂、3批配方颗粒样品及饮片原料中山柰素的含量，其中X厂家配方颗粒的整体转移率高于标准汤剂，但在生产工艺相同条件下，其不同批次产品转移率仍存在较大差异，提示配方颗粒的质控中原料应是权重最大的因素。本次研究受研究时限和样本数量限制，结论也不可避免地会有所偏差，因此这些结论尚需收集更大样本量进行分析和验证。至于配方颗粒能否代替标准汤剂的临床应用，仍待进一步的研究。