黄连素对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及淀粉样蛋白表达的影响

黄珍婷杨文明蔡志友

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常见的老年期痴呆类型，是一种中枢神经退行性疾病，以进行性的认知功能障碍及不同程度的行为损害为特征。随着人均寿命不断增加与社会老龄化，AD患病率逐渐升高[1]。AD导致的社会和经济问题已引起世界各国和社会的高度重视。AD的主要病理特征是细胞外以β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉积形成的神经炎性斑块(镜下可见的老年斑)，细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)及神经元丢失[2-5]。AD致病因素复杂，其发病机制有多种假说，存在一个共同点是Aβ积聚。大量研究表明，Aβ积聚可引起机体一系列病理变化，是导致AD发病的重要原因。这是目前被人们普遍接受的AD重要发病机制——Aβ级联假说[6-9]。黄连素又称小檗碱(berberine)，是从黄连、黄柏等植物中提取的异喹啉类生物碱，具有广泛的药理作用。有研究显示，黄连素具有抗炎、抗氧化应激、抑制胆碱酯酶活性、抑制Aβ蛋白聚集和Tau蛋白过度磷酸化等作用，因此其对AD防治具有巨大的潜力[10-15]。本研究探讨黄连素能否减少APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ的产生和积聚，改善其认知功能。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 黄连素(盐酸小檗碱，广东华南药业集团，规格：每粒0.1 g，批号：150904)；生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，规格：每袋100 mL，批号：18052902)；Western blot所用 Anti-beta Amyloid 1-42兔单克隆抗体(Abcam公司，批号：GR32357441，稀释浓度1︰1 000)；免疫荧光所用β-Amyloid鼠单克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号：10718，稀释浓度1∶100)；Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：134331)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：1326080)；DAPI染色液(碧云天，批号：p0010s)；GAPDH抗体(碧云天，批号：101917180302)；通用二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K185910E)。

1.2 主要仪器 天能化学发光凝胶成像系统(天能5200Multi)；耐可视(Nexcope)科研级生物正置显微镜(耐可视NE900)；水迷宫设备(江苏赛昂斯生物科技有限公司SA201)；电子旋转切片机(赛默飞HM 340E)；自动组织脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-TS3A)；超微量分光光度计(赛默飞ND One)；小型垂直电泳转印系统(Bio-Rad#1658033)。

1.3 分组及给药方法

1.3.1 实验动物 4月龄APP/PS1转基因小鼠20只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号[SCXK(京)2014-0004]，代养于重庆医科大学实验动物中心[SYXK(渝)2018-003]。实验过程中动物自由摄食和饮水。

1.3.2 分组和给药 采用SPSS 23.0统计分析软件将20只小鼠随机分为生理盐水组和黄连素组，每组10只。给药途径：首先将黄连素粉末加入生理盐水充分溶解后配成浓度为10 mg/mL的混悬液，小鼠适应性饲养1周后开始灌胃。使用灌胃器，将药液由动物口直接注入到动物胃中。黄连素组予100 mg/(kg·d)黄连素，生理盐水组给予等量生理盐水，每日1次于09：00灌胃，共4周。

1.4 Morris水迷宫实验检测准转基因小鼠学习记忆能力 Morris水迷宫设备采用江苏赛昂斯小鼠水迷宫视频分析系统。整套装置由圆形水池、小鼠站台、控温装置、摄像机及录像机、显示器、分析系统等构成，水池直径为120 cm，小鼠站台直径为8 cm，高度30 cm，水池水深(32.0±0.5)cm，水温(22±2)℃，水池分为4个象限，每个象限均有不同符号的导航标识。水迷宫实验共进行7 d，前6 d为定位航行试验，将小鼠头朝池壁依次放入第一、第二、第三、第四象限固定起始位置，其中第二象限为小鼠站台所在象限即目标象限，记录小鼠60 s内找到隐蔽于水面下的站台时间，此段时间称为逃避潜伏期(escape latency)；第7天除去站台，选择原站台位置对角线象限即第四象限将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠60 s内经过原站台所在位置的次数和在目标象限内的活动时间观察小鼠对原站台的记忆能力，此为空间探索试验(spatial probe)。

1.5 取材及标本制备

1.5.1 新鲜组织标本 小鼠经心脏灌注预冷的生理盐水后取脑。各组行为学测试完毕后从各组随机取5只小鼠，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，待深度麻醉后将小鼠固定于解剖台，剖开胸腔，暴露心脏，用4.5号静脉输液针，磨平针尖，连接预冷的生理盐水，针头刺入左心室，同时剪开右心耳，缓慢匀速地推注预冷的生理盐水防止蛋白降解，时间维持在10 min左右，待小鼠肝脏、眼睛变白，血液完全排出后断头、取脑并剥离海马组织。取出的海马组织经液氮速冻后放入-80 ℃冰箱冻存备用。

1.5.2 石蜡切片备制 取余下两组剩余5只小鼠，同样经心脏灌注预冷的生理盐水，待血液完全排出后，继续缓慢灌注4%多聚甲醛固定，直至动物呈僵硬状态。原位静置20 min后，剥离脑组织，采用上述固定液固定48 h。使用pH7.2～7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗干净后，用手术刀片将小鼠脑分成两半，依次经50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇两次、无水乙醇两次脱水，环保透明剂透明，低熔点石蜡、高熔点石蜡两次浸蜡，石蜡包埋。包埋后的石蜡运用石蜡切片机切片、展片仪展片，之后用干净的防脱黏附载玻片捞贴，烘干备用染色。切片前进行适当修片，于冠状位海马区连续切片，厚度 5 μm。

1.6 免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和免疫荧光(immunofluorescence，IF)分别检测Aβ42表达及其积聚沉积 免疫组化方法：取制备好的石蜡切片，两组10只小鼠，每只选择2张切片、65 ℃烤片3 h，放入环保透明中脱蜡，再经高浓度乙醇至低浓度乙醇复水便于后续染色。内源性过氧化物酶阻断后，将切片放入盛有柠檬酸缓冲液(pH6.0)容器中，置于微波炉内高火5 min加热至修复液沸腾后改用中火继续加热15 min进行抗原修复，增加组织通透性，取出容器放置室温冷却。PBS洗涤3次，每次5 min，之后用二抗来源动物的非免疫血清封闭非结合位点，37 ℃孵育30 min；后将封闭血清吸出，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜。次日从冰箱拿出复温20 min后PBS洗3次，每次5 min，再滴加反应增强液室温孵育20 min。经PBS洗3次，每次5 min后滴加二抗。PBS洗去二抗用新鲜配制的显色液于显微镜下控制显色时间。显色完成后自来水冲洗，将切片置于苏木素染色液孵育45 s染色组织细胞核，染色完成后将切片放入盛满自来水的盆中，流水冲洗后用1%盐酸乙醇分化9 s，分化完成后用流水反复冲洗后再用碳酸锂反蓝，时间为9 s。冲洗干净后用吹风机吹干切片，最后用中性树胶封片。免疫荧光方法基本同前，二抗使用Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗，染核使用DAPI染色液(DAPI Staining Solution，DAPI)，PBS充分洗净DAPI后，使用抗荧光淬灭封片剂封片。每张切片取3～5个视野，每张切片所取视野尽量相同，于40倍、100倍、200倍、400倍镜头下分别采集图像，使用Image J 8.0分析图像，测量累计光密度值(integrated optical density，IOD)和图像面积(Area)，用IOD/Area所得平均光密度(mean optical density，MOD)进行下一步统计分析。

1.7 Western blot检测APP/PSI转基因小鼠海马Aβ42的蛋白表达 取出冻存的新鲜小鼠脑组织进行称重，按照每20 mg组织加入150 μL新鲜配制的组织裂解液比例裂解组织，在冰上研磨组织使其充分裂解后放入预冷的4 ℃离心机以12 000 r/min离心15 min，小心吸取上清液，丢弃沉淀，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。调节各组蛋白样品浓度后，按照每4 μL蛋白样品加入1 μL蛋白上样缓冲液(5×)比例混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液，在100 ℃金属浴中加热5 min，使蛋白充分变性。按照BCA法所测蛋白浓度计算上样量，上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，分离全程80 V。之后250 mA恒流电转(湿转)至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)。转膜完成后，用5%脱脂牛奶配制封闭液进行非特异性位点封闭，摇床上室温封闭2 h，无须洗膜，直接将PVDF膜放入稀释后的一抗中(稀释浓度1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜。洗去一抗后将PVDF膜放入已稀释的二抗中(稀释浓度1∶5 000)，室温摇床孵育2 h。洗膜后用增强发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)发光成像。导出图片后利用Image J软件测定蛋白条带灰度值。使用目的条带灰度值/内参灰度值对所得的相对数进行统计分析。

2 结 果

2.1 Morris 水迷宫测试结果 定位航行试验中的1～6 d，每日取4个象限逃避潜伏期平均值进行统计，结果显示：两组小鼠逃避潜伏期均逐渐缩短，但与生理盐水组相比，黄连素组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短，第1天差异无统计学意义(P>0.05)，从第2天～第6天，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表1。空间探索实验中，两组小鼠60 s内经过原平台位置次数所得数据满足两独立样本t检验的要求。与生理盐水组相比，黄连素组小鼠经过原站台位置次数多，目标象限活动时间长，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2、图1。水迷宫实验结果提示，黄连素能改善APP/PS1转基因小鼠的学习和记忆能力。

表1 黄连素对APP/PS1转基因小鼠水迷宫定位航行实验逃避潜伏期比较(±s) s

与生理盐水组比较，1)P<0.05

表2 空间探索实验APP/PS1转基因小鼠穿过原站台次数和在目标象限活动时间比较(±s)

生理盐水组 黄连素组

2.2 Western blot检测APP/PS1转基因小鼠海马组织Aβ42蛋白的表达 黄连素组APP/PS1转基因小鼠行4周黄连素灌胃后，海马组织内Aβ42表达水平较生理盐水组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3、图2。Western blot结果提示，黄连素能降低转基因小鼠海马组织Aβ42的产生。

表3 黄连素对APP/PS1转基因小鼠海马组织Aβ42表达的影响(±s)

与生理盐水比较，1)P<0.05

图2 黄连素对APP/PS1转基因小鼠海马组织Aβ42表达的影响

2.3 免疫组化检测APP/PS1双转基因小鼠海马组织Aβ42蛋白的表达水平 与生理盐水组相比，黄连素组Aβ42染色平均光密度明显降低(P<0.05)，详见表4、图3。免疫组化结果提示黄连素能降低小鼠脑内Aβ42的表达。

表4 黄连素对APP/PS1转基因小鼠脑皮质Aβ42表达光密度值的影响(±s) IOD

与生理盐水组比较，1)P<0.05

生理盐水组 黄连素组

2.4 免疫荧光检测APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ的积聚 老年斑形状和大小不同，主要由Aβ构成，这些多肽聚集认为具有神经毒性。生理盐水和黄连素灌胃后APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑散在分布，相同视野下，与生理盐水组比较，黄连素组小鼠脑内老年斑形成减少，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表5、图4、图5。免疫荧光实验结果提示，黄连素能减少Aβ积聚形成的老年斑。

表5 黄连素对APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑形成的影响(±s) 个

与生理盐水组比较，1)P<0.05

图4 生理盐水组APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑形成的情况(IF，×40)

图5 黄连素组APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑形成的情况(IF，×400)

3 讨 论

随着我国老龄人口增加，AD是危及老年人生命健康的重要病因，AD发病原因、病理机制仍有待明确。对该病发病机制的研究，有效药物的开发对今后AD防治具有重要临床意义。具有广泛药理作用的黄连素是一种天然的异喹啉类生物碱，是我国应用长久的中药，可从多种植物中提取，如黄连、黄柏，主要药理作用包括抗炎、抑菌、降脂、降糖等[16-20]。黄连素价格便宜、服用简单、携带方便，是一种物美价廉的临床常用药物，随着深入研究，近年来黄连素在AD防治方面作用越来越受到关注。相关研究表明，黄连素能抑制胆碱酯酶活性，抗氧化应激，减少Aβ形成，抑制Tau蛋白的过度磷酸化。本研究探讨黄连素对AD模型小鼠认知功能和Aβ病理改变的影响。APP/PS1转基因小鼠是建立在Aβ沉积作为AD病理改变的中心环节发病机制假说，能较好地模拟AD病理改变的动物模型之一。采用Morris 水迷宫定位航行实验及空间探索实验能有效测试小鼠对空间定位(空间方向感和空间位置感)的学习记忆能力[21]。本研究结果显示，黄连素组小鼠表现为逃避潜伏期时间缩短和经过原站台位置次数增加及目标象限内活动时间增加优于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示中药黄连素能改善AD转基因小鼠的认知功能。

淀粉样斑块即老年斑沉积是AD的主要病理学特征。20世纪80年代Aβ认为AD病人脑内淀粉样沉积物的主要成分，其在AD发病及疾病进展过程中起到了重要作用。Aβ学说存在缺陷，如Aβ病理存在于认知功能正常个体中，临床症状与病理表现不相关。由神经元产生的Aβ其中一种聚合形式产生可溶性低聚体，这种聚合形成的寡聚体形式分子量小，能容易地进入突触等神经结构，认为具有神经毒性，造成线粒体损伤，引起氧化应激，诱导炎症反应及神经细胞死亡，最终导致AD发生。Aβ产生和清除失衡是AD发病机制关键[22]。降低Aβ的产生及加速Aβ的清除是AD治疗靶点。Aβ40和Aβ42是人体内Aβ常见的亚型，其是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶水解生成，由39～43个氨基酸组成。Aβ聚集能力一定程度上取决于自身的空间构型，Aβ为β片层结构，因其疏水性强，Aβ42更易聚积形成神经炎性斑块即构成镜下可见老年斑的主要成分，可能是Aβ主要的致病形式[23-24]。本研究应用多种分子生物技术检测黄连素对AD模型小鼠Aβ病理学影响，即能否影响Aβ42的表达水平和积聚。免疫组化和蛋白质印迹试验结果均显示黄连素组小鼠皮质及海马内Aβ42表达水平较生理盐水组降低；免疫荧光结果进一步表明黄连素能减少小鼠脑内老年斑的形成。

综上所述，中药提取物黄连素能改善AD模型小鼠的认知功能和减轻病理损害，但具体作用机制有待进一步研究和证实，如黄连素能否通过影响相关分泌酶活性改变APP水解途径减少Aβ生成或通过增加小鼠脑内Aβ的降解达到治疗目的。