牡蛎酶解工艺优化及其酶解产物对小鼠睾酮分泌的影响

张雪妍，秦小明,2,3,4，高加龙,2,3,4，林海生,2,3,4，章超桦,2,3,4，黄艳球



牡蛎酶解工艺优化及其酶解产物对小鼠睾酮分泌的影响

张雪妍1，秦小明1,2,3,4，高加龙1,2,3,4，林海生1,2,3,4，章超桦1,2,3,4，黄艳球1

（1. 广东海洋大学食品科技学院 / 2. 广东省水产品加工与安全重点实验室室/ 3. 广东普通高等学校水产品深加工重点实验室/ 4. 国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东 湛江 524088）

【】优化太平洋牡蛎（）酶解工艺条件，并研究酶解产物及其超滤组分对体外培养的睾丸间质细胞增殖及睾酮分泌的影响。以多肽得率为参考标准，对木瓜蛋白酶酶解牡蛎的加酶量、初始pH、酶解时间、酶解温度进行单因素及正交实验优化；通过MTT法及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同浓度牡蛎酶解产物及其超滤组分对TM3小鼠睾丸间质细胞增殖及睾酮分泌的影响。木瓜蛋白酶最佳酶解条件为加酶量3 000 U/g，初始pH 6. 5，酶解温度62.5 ℃，酶解时间4.5 h，在此条件下其多肽质量浓度为14.95 mg/mL；牡蛎酶解液及其超滤组分在 0.25~1.00 mg/mL质量浓度范围内，与空白对照组相比，能够显著增加TM3细胞的增殖活性（＜0.05），且具有浓度依赖性和时间依赖性。其中，< 5 ku 和5~10 ku超滤组分细胞增殖活性及促进睾酮分泌活性均最强。牡蛎酶解产物及其超滤组分可有效增强小鼠睾丸间质细胞增殖活性并促进其分泌睾酮。

牡蛎；酶解产物；小鼠睾丸间质细胞；增殖活性；睾酮

男性的雄激素主要由睾丸间质细胞分泌[1]，而睾酮作为最主要的雄激素，可以通过剂量依赖的方式促进精子的产生，并改善肌肉质量和增强体力，在维持男性健康方面发挥着重要作用[2-4]。但是睾丸间质细胞的数量会随着年龄的增长而减少，睾酮分泌量也随之减少，从而导致肌肉萎缩及骨质疏松等疾病发生[5]。最近研究表明，人工合成品睾酮替代物可以起到类睾酮作用，能够改善老年男性的肌肉量减少和骨质减少等症状[6-7]。

太平洋牡蛎（），也称长牡蛎，俗称生蚝、海蛎子等，是一种广温、广盐的内湾双壳贝类[8]。20世纪80年代初从日本引入我国，由于该品种产量高、适应性强、生长速度快、形态肥满等优点，在我国北方大面积养殖[9]，已逐步成为我国乃至全球牡蛎养殖的首选品种。太平洋牡蛎隶属于瓣鳃纲（lammelibranchia）牡蛎目（Osteroida）牡蛎科（Ostreidae）巨蛎属（）[10]，肉质鲜美，含有丰富糖原、蛋白质、氨基酸、牛磺酸、脂肪酸、维生素和无机盐[11]，因其营养价值极高，被冠以“海洋牛奶”“根之源”之美称[12]。牡蛎已被我国卫生部批准为药食两用材料[13]。牡蛎还具有广泛的生理活性，其提取物具有增强机体免疫[14]、抗氧化[15]、抗疲劳[16]、抗菌[17]、降血糖[18]、降血压[19]、醒酒护肝[20]等多种生物活性，此外有增强男性性功能的潜在药用价值[21]。研究表明，小分子牡蛎多肽可增加小鼠血清中胆固醇和性激素含量，提高小鼠的交配能力、性腺器官重量和脏器系数以及精子质量[22]。罗齐军等[23]研究发现，补充牡蛎多肽可以使大鼠血睾酮含量增加，从而改善长期大负荷训练导致的低血睾酮。上述研究均只证明了牡蛎提取物在动物实验中对大鼠或小鼠睾酮分泌有促进作用，但相关细胞实验及其分子机制目前尚未有研究报道。

本研究以太平洋牡蛎为原料，以多肽得率为指标对牡蛎的酶解工艺条件进行优化，利用体外促进小鼠睾酮分泌评价进行活性追踪，通过酶解、超滤等手段对活性成分进行有效富集，探究牡蛎酶解产物及其超滤组分对TM3雄性小鼠睾丸间质细胞增殖及分泌睾酮的影响，为研发促进男性睾酮分泌及生殖健康保健功能食品提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜太平洋牡蛎购于日本东京筑地市场（牡蛎酶解工艺优化及样品制备均在日本东京海洋大学实验室完成），木瓜蛋白酶（酶活力5×104U/g）购于广西南宁庞博生物有限公司，DMED/F12 培养基购自Gibco公司，马血清、青/链霉素双抗购自HyClone公司，噻唑兰（MTT）购自Genview公司，小鼠睾酮ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所，小鼠睾丸间质细胞（TM3）购于上海中科院细胞库。

1.2 仪器与设备

7780型高速落地冷冻离心机购自日本久保田商事株式会社，UV-1800型蛋白微量测定用分光光度计购自日本东京岛津科学株式会社，F-52型精密pH计购自日本帝国理化株式会社，FDU-2000型真空冷冻干燥仪购自东京理化器械株式会社，超滤装置及其超滤膜购自美国Milipore 公司，CKX41型倒置显微镜购自日本Olympus，SW-CJ-2FD型超净工作台购自苏州净化有限公司，Forma 370型CO2恒温箱、Multiskan FC型酶标仪购自美国Thermo公司，5810R型高速台式冷冻离心机购自德国Eppendorf 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 木瓜蛋白酶酶解牡蛎单因素条件选择 选用木瓜蛋白酶[24]，以多肽得率为指标，考察不同加酶量(1 000、2 000、3 000、5 000、7 000 U/g)、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酶解温度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）对多肽得率的影响。

1.3.2 正交实验设计 根据前期单因素实验结果，以加酶量、pH、酶解温度、酶解时间4个因素进行L9（34）正交实验设计，优化酶解条件。通过直观分析，得到最佳酶解条件。正交实验设计因素水平参见表1。

表1 正交设计因素水平

1.3.3 多肽含量的测定 根据鲁伟等[25]蛋白水解液中多肽含量的测定方法，基于三氯乙酸在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐而凝聚沉淀的原理，通过双缩脲法测定经三氯乙酸沉淀后上清液在540 nm下光密度值，对照牛血清蛋白标准曲线（= 0.052 4- 0.000 4，² = 0.999 6），得样品溶液中多肽浓度。

1.3.4 牡蛎酶解产物的制备流程 取新鲜牡蛎肉，经洗净、沥干，然后按料水质量体积比1∶3（g/mL）比例[26]加入预冷的蒸馏水，高速匀浆，加入木瓜蛋白酶，以正交实验得到的优化条件酶解牡蛎，酶解液沸水浴灭活10 min，冷却至室温，最后以8 000 r/min 离心20 min取上清液，部分留作下一步超滤分级，部分浓缩后冷冻干燥备用。

1.3.5 超滤分级 利用超滤搅拌装置及5、10 ku超滤膜对酶解液进行分级处理，进口压力控制在344.7 kPa，得到<5、5~10和>10 ku 3个超滤组分，收集各个组分，冷冻干燥备用。

1.3.6 MTT法检测牡蛎酶解产物及其超滤组分对TM3细胞体外增殖的影响 TM3细胞在D-MEM/F-12培养基（体积分数92.5%）中培养，该培养基补充有体积分数5%马血清和体积分数2.5%优质胎牛血清，37 ℃细胞培养箱中培养（体积分数5% CO2，湿度95%）。在96孔培养板上每孔加6 000个细胞进行种板，培养12 h后，将细胞用不同质量浓度（0、0.125、 0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的酶解产物及其超滤组分（<5、5~10和>10 ku)）进行处理，并分别培养12和24 h。培养结束后，用磷酸缓冲液PBS配置5g/L MTT溶液，每孔加入20 μL MTT溶液，并在培养板温育4 h。小心吸走上清液，向每孔中加入100 μL DMSO，然后摇动10 min。用酶标仪在570 nm处测量上清液的光密度值[27]。

1.3.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测睾酮含量 TM3细胞经不同质量浓度（0.25、0.50、1.00 mg/mL）牡蛎酶解产物及其超滤组分（<5、5~10和>10 ku）干预24 h，收集细胞培养上清液，3 000 r/min离心20 min取上清液，根据小鼠ELISA试剂盒说明书进行操作，检测细胞培养液中睾酮含量。

1.4 统计分析

采用Excel 2016、Origin 2017、SPSS 19.0对数据进行分析处理，用LSD多重比较进行差异显著性分析（= 0.05）。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解条件的确定

2.1.1 加酶量对酶解效果的影响 在pH 6.5，酶解温度60.0 ℃，酶解 5.0 h的条件下，考察不同加酶量对多肽得率的影响，如图 1 所示。多肽浓度随着加酶量的增加而逐渐上升，当加酶量超过 3 000 U/g后，多肽浓度无显著性变化（> 0.05）。这是因为酶解初始阶段底物和蛋白酶浓度较大，酶解速度较快；随着反应的进行，底物浓度逐渐减小，酶活力不断下降，酶解液中蛋白与酶的接触面积减少，酶解速度降低[28]。因此在加酶量超过3 000 U/g后，多肽得率不会随着加酶量的增加而增加，反而由于肽段开始被分解而出现多肽浓度缓慢降低的情况。为避免水解过度导致不必要的肽损失及节约成本等考虑，选取加酶量为3 000 U/g。

2.1.2 初始pH对酶解效果的影响 在加酶量3 000 U/g，酶解温度60.0 ℃，酶解5.0 h的条件下，考察不同初始pH对多肽得率的影响，如图 2 所示，pH 6.5 时，多肽浓度最高，且与pH 5.0、5.5和7.0具有显著差异（< 0.05）。由于牡蛎匀浆在添加木瓜蛋白酶后，初始pH值更接近于pH 6.5，且木瓜蛋白酶在pH 6.5时对牡蛎具有理想的酶解效果[24]，故选择6.5为初始pH。

凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

2.1.3 酶解温度对酶解效果的影响 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解 5.0 h的条件下，不同酶解温度对多肽得率的影响如图 3 所示。随着温度的升高，多肽浓度呈现先上升后下降趋势，在60 ℃时达到最大值，超过此温度后多肽浓度显著降低（< 0.05），这是由于蛋白酶在高温条件下会变性失活，失去其切断肽链的作用。由于高温条件对样品生物活性和木瓜蛋白酶酶活力的不利影响，选用 60 ℃作为酶解温度。周燕芳等[29]在通过单因素实验优化木瓜蛋白酶酶解海产小杂鱼时，其肽回收率和水解度在酶解温度60 ℃时均最高，酶解效果最好，该结果与本实验结果一致，说明木瓜蛋白酶在60 ℃时酶解活性最强。

2.1.4 酶解时间对酶解效果的影响 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解温度60 ℃，考察不同酶解时间对多肽得率的影响，如图 4 所示。多肽浓度呈现先上升后下降趋势，多肽浓度在酶解时间4.0~6.0 h间，多肽浓度无显著性变化（> 0.05），是由于酶解初始阶段底物浓度和蛋白酶浓度较大，酶解速度快；随着反应进行，底物浓度减小，酶活力下降，酶解速度降低。因此为了避免水解过度导致肽损失及节约时间成本考虑，选取酶解时间4.0 h为宜。

凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

2.1.5 正交实验结果 由表2所示，根据正交实验结果极差值可确定各个因素影响酶解效果的主次关系，即：加酶量＞pH＞酶解时间＞酶解温度。根据正交实验结果值可得出最佳酶解条件为2232,即加酶量3 000 U/g，pH 6.5，酶解温度62.5 ℃，酶解时间 4.5 h，在此条件下，牡蛎酶解液多肽含量最高。经实验验证，此条件下酶解得到的多肽质量浓度为 14.95 mg/mL。

2.2 牡蛎酶解产物及其超滤组分对TM3细胞体外增殖的影响

TM3细胞经不同质量浓度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的牡蛎酶解产物及其超滤组分（<5、5~10和>10 ku）干预12 h及24 h后，细胞活性如图5、6所示。如图5所示，在12 h作用时间内，随着牡蛎酶解产物及其超滤组分的作用浓度逐渐增加，TM3细胞的细胞活性也逐渐增强，与空白对照组相比，除牡蛎酶解产物在质量浓度0.125 mg/mL的组分外，其余组分细胞活性均显著增强（＜0.05），且牡蛎酶解产物及其超滤组分四个组分增强细胞活性均表现为浓度依赖性（＜0.05）。如图6所示，在24 h作用时间内，酶解产物及其超滤组分对TM3细胞的细胞活性随着样品浓度的增加，呈先增强后减弱的趋势，这是由于随着作用于细胞的样品浓度增高，时间增长，样品对于细胞的作用会从促进逐渐转为抑制。但各质量浓度组分（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）相较于空白对照组，细胞活性均显著增强（＜0.05）。说明酶产物及其超滤组分对TM3细胞具有细胞增殖活性，除＞10 k超滤组分在1 mg/mL质量浓度下对TM3细胞增殖活性最强，其余组分的最佳作用质量浓度均为0.500 mg/mL。KIM等[22]研究了海马酶解产物对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响，海马酶解产物在0.2、0.5和1.0 mg/mL质量浓度下作用于TM3细胞24 h 后，均显着增强了细胞活力，且其最佳作用浓度在0.5~1.0 mg/mL之间。该结果与本实验结果相似，说明水产品蛋白酶解产物的生物活性物质质量浓度在0.5~1.0 mg/mL区间对睾丸间质细胞均具有较好的增殖活性。与海马酶解产物相比，在0.5 和1.0 mg/mL 质量浓度作用下，牡蛎酶解产物促进TM3 增殖活性的效果优于海马酶解产物。

表2 牡蛎酶解工艺优化L9 (34)正交试验直观分析

同组别不同样品浓度间凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

同组别不同样品浓度间凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

12 h与24 h细胞活性相比较，在0.125~1.000 mg/mL质量浓度范围内，不同组分的24 h细胞活性在相同浓度下均高于其12 h细胞活性（＜0.05），说明牡蛎酶解产物及其超滤组分对TM3细胞增殖活性具有时间依赖性。比较12 h及24 h不同组分的细胞活性增殖情况，超滤组分（<5、5~10和>10 ku）的细胞增殖活性明显强于牡蛎酶解产物组（＜0.05），说明经过超滤分级，促进TM3细胞增殖的有效活性成分得到了富集。

在12 h作用范围内，>10 ku超滤组分对TM3细胞增殖活性最显著，且具有显著的浓度差异（＜0.05）。到24 h作用后，<5、5~10 ku超滤组分的增殖效果更明显，且最佳有效作用质量浓度（0.500 mg/mL）较>10 ku组分（1.000 mg/mL）更低。综合分析，>10 ku组分只是培养前期促进细胞增殖速度较快，24 h作用后增殖效果不及<5、5~10 ku 超滤组分（＜0.05），故<5、5~10 ku 超滤组分对TM3细胞增殖活性最强。

2.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测睾酮含量

根据MTT法测得作用24 h细胞活性试验结果，经显著性差异分析，得出0.25、0.50、1.00 mg/mL 3个质量浓度作用下TM3细胞的细胞增殖活性显著高于其他质量浓度（＜0.05），故将这3个浓度的牡蛎酶解产物作用于TM3细胞24 h后，测TM3细胞分泌睾酮含量，经酶联免疫吸附实验（ELISA）得出结果如图7所示。与空白对照组相比，＜5 ku和5~10 ku超滤组分在0.25、0.50 和1.00 mg/mL质量浓度条件下，睾酮分泌均显著高于空白对照组（＜0.05），且具有浓度依赖性（＜0.05），说明＜5 ku和5~10 ku超滤组分可以有效促进TM3细胞分泌睾酮。＞10 ku超滤组分及牡蛎酶解产物组虽在0.25、1.00 mg/mL条件下与空白对照无显著性差异（> 0.05），但在0.50 mg/mL条件下，睾酮含量显著高于空白对照组（＜0.05）。说明牡蛎酶解液及＞10 ku超滤组分在0.50 mg/mL条件下，能有效促进TM3细胞分泌睾酮。3个组分相比较，<5 ku和5~10 ku 超滤组分对促进TM3细胞分泌睾酮活性较强。

KIM等[27]研究海马酶解产物对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响，发现海马酶解产物对促进小鼠间质细胞分泌睾酮具有浓度依赖性，说明海洋资源中潜在的生物活性物质可以通过酶法水解得到释放，通过酶解海洋生物制备活性物质具有较高的研究意义。相关动物实验研究[22]已表明牡蛎酶解产物可显著提高小鼠血清睾酮水平，而本研究通过对TM3细胞体外培养，测定牡蛎酶解产物对TM3细胞作用下对其分泌睾酮的影响，对牡蛎酶解产物提高小鼠血清睾酮水平提供了机制的初步探究和实验支持，因此牡蛎酶解产物提高小鼠血清睾酮水平可能是通过作用于小鼠睾丸间质细胞，促进其增殖及睾酮分泌而来实现其功能作用。

同组别不同样品浓度间凡有一个相同标记字母即为差异不具统计学意义（P > 0.05）

4 结论

1）通过单因素实验及正交试验分析，确定木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为加酶量3 000 U/g、pH 6.5、酶解温度62.5 ℃、酶解时间 4.5 h，在此条件下太平洋牡蛎酶解得到的多肽质量浓度为14.95 mg/mL。

2）牡蛎酶解液及其超滤组分在0.25 ~ 1.00 mg/mL 质量浓度范围内，能够显著增加TM3细胞的增殖活性，且具有浓度依赖性和时间依赖性；牡蛎酶解液及其超滤组分能够显著提高TM3细胞分泌睾酮，尤其是＜5 ku和5~10 ku两个超滤组分。因此牡蛎酶解液及其超滤组分能有效增强TM3细胞增殖活性并促进其分泌睾酮。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis fromand Effects of Its Enzymatic Hydrolysate on TM3 Leydig Cells

ZHANG Xue-yan1,QIN Xiao-ming1,2,3,4, GAO Jia-long1,2,3,4, LIN Hai-sheng1,2,3,4,ZHANG Chao-hua1,2,3,4, HUANG Yan-qiu1

（1.,/ 2./ 3./ 4.,524088,）

【】To optimize the enzymolysis process conditions ofand explore the effects of enzymatic hydrolysate and its ultrafiltration fractions on cell proliferation and testosterone secretion in the TM3 leydig cells.【】Based on the peptide yield, the single factor optimization and orthogonal experiments were carried out to get the best amount of enzyme, initial pH, temperature and time of enzymatic hydrolysis for papain to hydrolyze oysters. The MTT assay and ELISA kit were used to detect the effects of the proliferation and secretion of testosterone in the TM3 cells, which were treated by different concentrations of oyster hydrolysate and its ultrafiltration fractions.【】The optimal enzymatic hydrolysis conditions for papain are as follows: enzyme addition 3 000 U/g, initial pH 6.5, temperature 62.5 ℃, and time 4.5 h. Its peptide concentration is 14.95 mg/mL. Oyster hydrolysate and its ultrafiltration fraction can significantly increase the proliferation activity of TM3 cells in a concentration range of 0.25-1.00 mg/mL when it is compared with the blank control group in a concentration- and time-dependent manner（＜0.05）. The ultrafiltration components of <5 ku and 5-10 ku significantly enhanced cell proliferation and promoted testosterone secretion.【】The oyster hydrolysate and its ultrafiltration component can effectively enhance the proliferation of mouse Leydig cells and promote the secretion of testosterone.

; enzymatic hydrolysate; leydig cells; proliferative activity; testosterone

Q954.4

A

1673-9159（2019）03-0096-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.013

2019-01-25

贝类产业技术体系（CARS-49）；广东省应用型科技研发专项资金项目（2016B020235002）

张雪妍（1992－），女，硕士研究生，研究方向：水产品加工与贮藏。E-mail:1162742815@qq.com

秦小明（1964－），男，教授，研究方向为海洋生物资源高值化利用、水产品保活运输。E-mail:xiaoming0502@21cn.com

张雪妍，秦小明，高加龙，等. 牡蛎酶解工艺优化及其酶解产物对小鼠睾酮分泌的影响[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（3）：96-102.

（责任编辑：刘朏）