干酪中的生物活性肽及其作用

焦晶凯，刘振民，苏米亚，郑远荣，刘景

（乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海200436）

0 引 言

人们通常所说的干酪是使用凝乳酶、菌种、热酸化的一种或几种方法将牛奶凝乳形成，干酪也可以称作奶酪。世界上的干酪可以根据牛乳来源、制作工艺、脂肪含量、发酵类型和所含菌种进行分类，其种类可以分为上千种[1]。

干酪生物活性肽在干酪成熟过程中产生，在这一过程中，牛乳中的各种蛋白酶、凝乳酶和LAB代谢酶类发挥重要作用，从而不断的合成释放多肽，其种类和数量受蛋白水解因素的影响，如pH值，酶的类型，盐水比，湿度，储存时间和温度[2-3]，因此不同品种的干酪会产出不同生物活性的多肽，例如抗高血压，抗氧化，抗增殖等活性，本文主要针对以上几个类型的干酪活性肽就目前的研究进展进行概述。

1 抗高血压肽

在发达国家，高血压是影响多达30%成年人的慢性病，并可能诱发并发症，如中风和冠心病。在人类系统中，其中控制血压的一种生理途径是肾素-血管紧张素-醛固酮系统。该系统的关键组成部分是血管紧张素I转换酶（ACE），它可以催化血管紧张素I向血管收缩剂血管紧张素II转化，并同时降解血管扩张剂缓激肽和胰激肽。这两个反应导致血管收缩和醛固酮释放，增加钠浓度和血压。因此，抑制这种酶可以起到降压作用。世界大多数高血压患者在接受治疗时使用ACE抑制药物如卡托普利或依那普利。随着牛奶发酵和成熟过程中释放的多肽序列鉴定，干酪已被广泛作为ACE抑制剂的潜在来源。表1为部分干酪的水溶性和/或乙醇溶性提取物（WSE，ESE）及其相应的ACE抑制活性。有学者鉴定了来自Roquefort-type干酪的多肽,序列为YQGPIVLNPWDQVKR，与αS2酪蛋白具有相似序列，此干酪表现了较强ACE抑制活性[4]。一些含有VPP和IPP序列的多肽具有ACE-抑制活性，有学者在布里干酪（Brie）、切达干酪（Cheddar）、艾达姆干酪（Edam）、高达干酪（Gouda）、戈尔贡佐拉（Gorgonzola）和格鲁耶尔（Gruyere）及其他一些干酪中发现了序列为VPP和IPP的抗高血压β-酪蛋白肽[5-6]。Stuknytè等人[5]也在不同干酪如布里干酪（Brie）、切达干酪（Cheddar）、戈尔贡佐拉（Gorgonzola）和马斯丹（Maasdam）等干酪中鉴定了酪蛋白水解产物中含有抗高血压αs1-酪蛋白衍生肽AYFYPEL和RYLGY。虽然在一些干酪提取物中发现ACE抑制活性肽及一些抗高血压肽的存在，但仍需进一步在动物模型中证实干酪的抗高血压作用。

表1 部分干酪中血管紧张素I转换酶（ACE）抑制活性及鉴定作用多肽

2 抗氧化肽

由于活性氧产生增加引起（ROS）的氧化应激，会引起细胞的抗氧化能力下，进而会引发一系列人类疾病，包括心血管疾病，代谢疾病，炎症，神经退行性疾病和癌症并且加速老化过程。天然抗氧化剂可以对氧化应激进行内源性抵抗，食物中所含有的肽是天然的抗氧化剂，没有严重的副作用。其中，牛奶蛋白质是最重要的天然肽来源之一[10-11]。

有学者测定了巴尔米贾诺雷吉亚诺（Parmigiano-Reggiano）干酪水溶性多肽提取物的自由基清除活性，其抗氧化活性完全不受成熟时间和胃肠消化的影响[12]。Meister Meira等人[5]测定了巴西的菲达干酪（Fata）、洛克福干酪（Roquefort-type）和羊乳干酪（Pecorino-type）的水溶性提取物抗氧化活性，结果显示菲达干酪、洛克福干酪的ABTS清除自由基能力分别是32%~45%和87%。Roquefort-type干酪的DPPH自由基清除活性最强，其序列与以前表征过具有抗氧化活性的肽有很高的同源性。最近，在布尔戈斯型（Burgostype）干酪中鉴定出三种来源于αs1-和β-酪蛋白的肽。其中一种同源于αs1-酪蛋白（SDIPNPIGSENSEKTTPLLW），是一种新的肽，具有潜在的抗氧化活性[13]。这些结果表明干酪是抗氧化肽的良好来源，但仍需动物模型和人体试验进一步验证。

3 神经肽

类阿片药物肽是一类具有兴奋剂和拮抗作用的阿片μ-受体配体。研究得最多的乳源阿片受体配体是由β-酪蛋白衍生的一类肽，称为β-酪啡肽（BCM）。除了对中枢神经系统的影响之外，BCMs已被证明能够诱导肠粘液分泌、增加血浆胰岛素水平、降低胰高血糖素水平、并提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性[14-15]。UIHaq等人[16]还找到了BCMs的其他一些益生作用。

Sienkiewicz-Szlapka等人[17]测定了三个半硬质干酪（艾达姆Edamski、高达Gouda和卡斯特兰Kasztelan）以及两种成熟霉菌干酪（布里Brie和罗克波尔Rokpol）中的类阿片肽含量，包括具有兴奋剂作用BCM7和BCM5、拮抗作用的casoxin-6和casoxin-C（衍生自牛κ-酪蛋白）和乳铁蛋白A（衍生自乳铁蛋白）的含量。发现霉菌干酪中BCMs的含量高于半硬干酪，它含有相当高的casoxin-6。除Gouda外，所有其他干酪提取物都被发现能够影响分离的兔回肠的肠动力，类似于吗啡作用。类似的，DeNoni和Cataneo[18]测定了戈尔贡佐拉Gorgonzola、山羊干酪Caprino,、布里 Brie、意大利 Taleggio、高达 Gouda、芳提娜Fontina、切达Cheddar和格拉纳帕达诺GranaPadano干酪及其消化产物中BCMs含量，除了Taleggio、Caprino和GranaPadano干酪，均检测出BCM7。随后Toelstede等人[19]也证实在成熟的Gouda奶酪的WSE中存在BCM10（β-酪蛋白（60-69））。在意大利山羊干酪CaprinodePiemonte的WSE中也发现BCM9[20]。

关于类阿片药物肽的实际生物利用度研究较少，仅在喂食2周和4周龄含酪蛋白配方食物的小鼠血浆中检测到BCM[21]。在喂食母乳和牛乳的婴儿血浆中检测到了具有免疫反应性的BCMs[22]。有必要继续探索BCMs在人类健康中的作用，以及应用改进的诊断技术进行体内实验验证。此外，还需要更多的研究来评估这些肽在复杂的食物基质中的吸收程度。

4 抗增殖肽

已经有一些体内体外实验研究了牛奶蛋白（如乳铁蛋白和乳铁蛋白）具有抑制癌细胞的生长能力，主要作用是在肿瘤生长中充当细胞凋亡诱导剂。然而，相应抗增殖特性的肽序列并没有鉴定出来。截至目前，有研究验证了干酪提取物具有抗增殖作用，但所有描述的结果都基于干酪提取物或干酪乳清，并非干酪本身。Yasuda等人[23]验证了12种商业干酪提取物对细胞生长和HL-60人早幼粒细胞白血病细胞中诱导DNA断裂中起到的作用。其中蒙塔格纳德干酪Montagnard，蓬莱韦克干酪Pont-l'Eveque，布里干酪Brie，卡门贝尔干酪Camembert，丹麦蓝纹Danablue和蓝纹干酪Bluecheese提取物具有最高的抗增值活性。还指出，不同干酪成熟度与它们的抗增殖活性之间呈正相关。

有学者研究马苏里拉干酪的乳清样品可以减少43%的Caco2细胞的增殖。从原奶中提取的多肽并没有这种作用，说明特定的生物活性物质是在干酪的生产过程中释放的[24]。随后，该学者使用RP-HPLC纯化多肽片段，并使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF/MS进一步鉴定这些活性多肽，大多是由κ-酪蛋白肽和β-酪蛋白衍生而来[25]。

5 抗菌肽

迄今为止，几乎所有公开发表出版物涉及的干酪的抗菌特性都是基于水溶性多肽提取物质WSE的，而且很少有鉴定其中的功能性多肽序列。Théolier等人[26]测定了来自五种商业奶酪（莫扎里拉干酪，高达干酪，瑞士干酪，以及中度和重度成熟的切达干酪）的WSE的抗菌活性，在通过Sep-Pakclean柱分离以前，莫扎里拉和高达干酪的WSE可以抑制高达4.66个对数周期的李斯特菌ListeriaivanoviiHPB28、单核细胞增生李斯特氏菌ScottA3、大肠杆菌MC4100和大肠杆菌O157：H7。但是，在脱盐后，几乎没有抗单核细胞增生李斯特氏菌ScottA3和大肠杆菌O157：H7的活性，这就难以说明抗菌性来自干酪的WSE还是其中的有机酸或盐，该研究凸显了在测定干酪的WSE活性之前，纯化步骤的重要性。莫扎里拉、高达和瑞士干酪脱盐后的WSE可以诱导几种食源性霉菌的孢子萌发延迟。此外，还有学者[27]研究了阿西雅格干酪Asiagod'Allevo纯化后的WSE活性，表现出对威尔斯李斯特菌L.innocuaLRGIA01有一定的抗菌性能。埃门塔尔干酪EmmentaldeSavoie纯化的WSE也被证实具有抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株162的活性[28]。虽然迄今为止，没有公开发表的体内研究数据直接表明食用干酪具有抗菌影响。但是，一些干酪提取物被证实确有一定的抗菌作用。

6 矿物质吸收的调节肽（磷酸肽）

磷酸肽CPPs是具有不同程度磷酸化的生物活性肽，它通过体外和体内释放的酶不同程度的水解酪蛋白形成的。因为这些肽具有较高净负电荷，它们可以有效地结合二价阳离子形成可溶性复合物。因此磷酸肽是防龋的有效物质。除了具有金属螯合性能外，CPP还具有其他生物活性，如抗氧化、免疫调节、胃分泌调节、抗菌剂以及对成骨细胞生长和分化的刺激活性[29-30]。

近年来，一些研究已经从不同类型干酪中分离、表征和鉴定了CPPs。通过分析总的WSE和浓缩沉淀的方法分析验证CPPs的存在。尽管许多干酪品种中的酶是共通的，但是不同干酪的肽组份都是独特的，并且受到成熟过程的影响。在Comté干酪中，β-和αs2-酪蛋白的原始切割归因于纤溶酶，这是一种碱性牛奶蛋白酶，其具有切割β-酪蛋白的K28-K29和αs2-酪蛋白的K21-Q22的胰蛋白酶的特异性。这两种肽通过内肽酶和氨肽酶以及赖氨酰羧肽酶的作用进一步水解。因此CPPs可以被认为是干酪中暂时存在的中间成分。它们要么积聚，要么被干酪酶降解成更短的肽和游离氨基酸，包括磷酸化的丝氨酸，大多数CPPs来自β-酪蛋白的区域（14-28）。特定肽的积总是取决于生产和降解酶与母体底物可利用性之间的微妙平衡。在Ragusano干酪的中，鉴定的可溶性肽的数量在成熟4个月和7个月后分别从123显着降低至47和25[31-32]。

据报道，CPPs在肠道释放并在发生矿物质吸收的小肠（回肠）的底部积聚。因此，一些研究旨在研究CPPs是否可以增加矿物质吸收，尤其是Ca2+吸收。虽然这些研究为CPPs改善矿物质吸收提供了可观的证据，但结果仍存在争议[33]。CPPs的作用影响也可能受到群体身体状况、CPPs水平和钙磷比值的影响。

表2 部分干酪中来自于αs1-，αss-和β-酪蛋白的磷酸肽

（续表2）

7 结 论

干酪在世界各地被广泛的消费，并且在对人类的健康中发挥重要作用，例如，降血压和抗氧化等。干酪的组成证明了它是一个良好的生物活性物质释放基质。虽然已有大量的研究证明干酪中的肽能给人类的健康带来益处，但是仍有必要通过一定的技术手段进一步鉴定分离生物活性肽，如代谢组学的应用。此外，实施新鲜和成熟干酪中生物活性肽对健康影响的体内和体外研究证明也是相当必要的。