牦牛酥油功能性中链脂肪酸（MCFA）和支链脂肪酸(BCFA)纯化工艺研究

袁锦莹,孙万成,罗毅皓

（青海大学农牧学院，食品加工与安全，西宁810016）

0 引 言

牦牛酥油是以传统手工工艺从牦牛乳中提炼出的奶油，能为人体提供充足能量，并且具有保健功能[1-2]。研究表明，牦牛酥油中饱和脂肪酸的组成及含量与普通牛乳极为相似[3-4]。其饱和脂肪酸（SFA）与不饱和脂肪酸（UFA）含量均高于普通奶油[5]。喻峰等[6-7]报道了牦牛酥油中的UFA对人体健康具有意义，但对于酥油当中的其他脂肪酸组分目前鲜有报道。

研究证实中链脂肪酸（MCFA）能够降低体重、减少体脂及改善血脂代谢，对动脉粥样硬化及心脑血管疾病带来有益的作[8-10]。而支链脂肪酸（BCFA）对人体具有独特而重要的功能和作用,如防止坏死性小肠结肠炎[11-12]，同时有研究表明BCFA还具有抗癌作用[13-14]。

尿素络合是脂肪酸分离纯化的传统方法，利用尿素分子将SFA及MUFA络合，以达到分离纯化目的[15-16]。结晶温度越低，尿素用量越多，所得纯度越高[17]。基于此，本研究采用过氧乙酸氧化法除去不饱和组分原理，结合尿素络合对牦牛酥油中的功能性脂肪酸进行分离纯化，为牦牛酥油开发利用提供基础数据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

牦牛酥油，青海果洛；尿素，上海广诺化学科技有限公司；氢氧化钾，天津红岩试剂厂；无水硫酸钠，天津恒兴化学试剂制造有限公司；无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司；正己烷，天津富宇精细化工有限公司；过氧乙酸，天津富宇精细化工有限公司；正丁醇，天津富宇精细化工有限公司；三氟化硼甲醇，成都艾科达化学试剂有限公司；定性滤纸抚顺东阳工贸有限公司；广泛试纸，杭州试三科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（JM-B 3003），诸暨市超泽衡器设备有限公司；恒温振荡器（THZ-32），常州国华电器有限公司；旋转蒸发器（RE-2000B），上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；旋涡混合器（MVS-1），北京东方开物科学器材有限公司；医用离心机（LC-04C），江苏正基仪器有限公司；气相色谱质谱联用仪（DSQⅡ），赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 游离脂肪酸的制备

采用皂化-酸化法制取游离脂肪酸。酥油中的脂肪与碱发生皂化，生成脂肪酸盐。此外其中的游离脂肪酸也可与碱发生中和反应，生成脂肪酸盐。再经酸化，被有机溶剂萃取便可制得混合的游离脂肪酸。吴明一[22]在用尿素络合纯化葵花籽油的不饱和脂肪酸的研究中，便是采用皂化-酸化法制备混合脂肪酸。Udaya N等[23]在用尿素络合法纯化海豹油的omega 3系列多不饱和脂肪酸也是用同等方法制取混合脂肪酸。

1.3.2 脂肪酸甲酯的制备

取适量（30 g）游离脂肪酸，加入质量分数为1%的硫酸-甲醇溶液100 mL，锡纸封口后60℃水浴30 min。待冷却后加入50 mL的正己烷及50 mL饱和NaCl溶液，萃取取正己烷层。正己烷层水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷层，用适量无水Na2SO4吸水干燥后过滤。滤液用旋转蒸发仪（40℃）旋蒸获得游离脂肪酸甲酯，低温（-20℃）保存备用。

1.3.3 脂肪酸甲酯的过氧化

脂肪酸甲酯的过氧化目的是使不饱和脂肪酸的双键氧化生成饱和脂肪酸。加入过氧乙酸（过氧化氢与乙酸1:1配置），设定三个单因素脂肪酸与过氧乙酸比值为1:1、1:2、1:3反应以判断过氧化程度[24]。再加入正己烷进行萃取，取正己烷层。将正己烷层水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷层，用适量无水Na2SO4吸水干燥后过滤。滤液用旋转蒸发仪（40℃）旋蒸获得过氧化后的游离脂肪酸甲酯，低温（-20℃）保存备用。

图1 过氧化去除不饱和脂肪酸及生成环氧脂肪酸

1.3.4 一次络合

络合结晶：取15 g上述过氧化后所得游离脂肪酸甲酯，加入脂肪酸与尿素比值1:2和甲醇（甲醇：尿素+脂肪酸甲酯，5:1）。封口后，60℃水浴并振荡至澄清透明。放置冰箱4℃，8-10 h保存，络合结晶。之后对所得液相和固相（结晶络合物）进行抽滤，并用少量甲醇冲洗瓶壁和滤渣，获得固相（UCF）和液相（NUCF）。

NUCF处理：用盐酸溶液酸化至pH 2-3后加入饱和食盐水。随后用正己烷萃取，取正己烷层。水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷层，用适量无水Na2SO4吸水干燥后过滤。滤液用旋转蒸发仪（40℃）旋蒸获得游离脂肪酸甲酯，低温（-20℃）保存备用。

UCF处理：同NUCF。

1.3.5 二次络合

取上述脂肪酸甲酯，加入适量KOH-甲醇溶液，封口后于恒温振荡器60℃1 h，并振荡。用盐酸溶液酸化至pH 2-3。随后进行破乳、萃取、水洗及干燥、蒸发等步骤，获得游离脂肪酸。之后进行丁酯化，用1%（W/W）的硫酸的正丁醇溶液酯化，得到丁脂，后续操作为破乳、萃取、水洗及干燥、蒸发得到脂肪酸丁酯。尿素络合脂肪酸丁酯。（4℃，8-10 h保存后抽滤、酸化、破乳、萃取、水洗及干燥、蒸发），最终获得脂肪酸丁酯。

1.3.6 GC-MS的前处理--甲酯化

甲酯化将脂肪酸中的高沸点不易挥发的组分转化成低沸点易挥发的脂肪酸甲酯，以进行GC-MS分析。本研究以三氟化硼作为催化剂，对游离脂肪酸进行甲酯化。

取100微升脂肪酸样，加入质量分数为15的BF3甲醇4 mL，封住试管口后，90℃水浴30~60 min，冷却后加入2 mL的正己烷，振摇，加入2 mL的饱和食盐水，振摇。3 500 r/min离心5 min。取正己烷层于另一支干燥试管中，加入少量无水硫酸钠除湿，振摇。轻轻吸取正己烷层于新的干燥试管，在氮气下吹干，此时油脂析出附着在管壁，用0.5 mL正己烷再次润洗收集油脂得到甲酯化样品以备GC-MS分析。

1.3.7 GC-MS分析

气相色谱-质谱分析：柱子型号DB-5MS 60m×0.25 mm×0.25μm广州费尼根仪器有限公司；色谱柱：柱子型号为ZB-5MS 60 m×0.25 mm×0.25μm。起始温度60℃保持1 min，以10℃/min升至180℃，再以4℃/min升至280℃，保持20 min；再以20℃/min升至，保持2 min。进样孔温度为280℃。载气：高纯He(99.999%)，流速为1 mL/min。连接杆温度为285℃。离子源温度为250℃。溶剂延迟时间7 min。质量扫描范围：40~550 u。

用化学工作站数据处理系统检索谱图库，进行谱图解析，确认各个脂肪酸的化学结构。用峰面积归一化法定量计算各脂肪酸的相对含量。

1.3.8 计算

1.3.9 统计方法

利用SPSS 16.0软件分析统计组的差异性，采用最小显著差数法，计量数据用平均值±标准差，采用t检验，P＜0.05表示脂肪酸差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 富集相的确定

表1 固相（UCF）和液相（NUCF）脂肪酸成分对比

从表1可看出，尿素络合后液相（NUCF）中的MCFA、PUFA及BCFA含量分别为15.72%、5.94%和13.67%，而在固相（UCF）中分别为3.9%、0.91%和1.2%。因此可判断，尿素络合纯化牦牛酥油的中链脂肪酸（MCFA）及支链脂肪酸（BCFA）的富集相是液相（NUCF）。

2.2 不同比例过氧乙酸对过氧化程度的影响

2.2.1 不同脂肪酸/过氧乙酸比值对两次络合终产物的影响

表2 不同脂肪酸/过氧乙酸比值对两次络合终产物的影响

从表2可看出，脂肪酸/过氧乙酸不同比值对两次络合后的产物有不同影响，原酥油中的中链脂肪酸（MCFA）相对含量为6.37%、支链脂肪酸（BCFA）相对含量为3.31%、多不饱和脂肪酸（PUFA）相对含量为1.74%。两次络合后，脂肪酸/过氧乙酸比值1:2时MCFA的纯度最高，达到28.66%，脂肪酸/过氧乙酸比值1:3时BCFA的纯度最高，达到15.91%。C16:0、C18:1n9、C18:0等在原料酥油中含量较多，但在试验处理后含量大幅度降低，主要的原因是尿素分子能够较好络合C16:0、C18:0，使其转入到固相而去除；C18:1n9相对含量较大幅度降低的主要原因是其双键被氧化形成环氧脂肪酸和饱和脂肪酸[21]。

2.2.2 脂肪酸/过氧乙酸比值1:3时各阶段产物的脂肪酸成分变化

表3 脂肪酸/过氧乙酸比值1:3时各阶段产物的脂肪酸成分比较

从表3可知，将脂肪酸甲酯过氧化后脂肪酸成分发生了显著性差异（P<0.01），MCFA纯度由最初的6.37%提高到67.7%，提高近10倍左右，可能原因是长链不饱和脂肪酸被强烈的氧化，在双键位置发生断裂，生成了中链脂肪酸。PUFA在过氧化后有一定程度的降低，两次络合后BCFA相对含量升高近5倍。尿素络合法能够分离纯化BCFA，是因为尿素能够络合SFA及MUFA，与之形成较稳定的络合物[16，21]。

由图2和图3可知，过氧化酥油产物中产生大量C10:0和C12:0，可能致使C18:1n9被强烈氧化，发生双键部位的断裂二生成C10:0和C12:0；也可能是由于尿素分子不能络合C10:0和C12:0脂肪酸，而使其富集液相（NUCF）部分。

图2 原酥油GC/MS图谱（C8:0,RT11.55,area0.05%;C10:0,RT14.62,area0.54%;C12:0,RT17.94,area3.03%）

图3 过氧化酥油GC/MS图谱（C8:0,RT11.52,area15.37%;C10:0,RT14.58,area24.5%;C12:0,RT17.84,area25.1%;）

此外，在进行过氧化与两次络合后产生了新的中间产物—环氧脂肪酸甲酯，脂肪酸/过氧乙酸比值1:3时二次络合后的相对含量为11.56%。环氧脂肪酸甲酯是类常用环保增塑剂，在塑料加工中添加增塑剂可使材料柔韧性增强。但普遍使用的增塑剂为人工合成的邻苯二甲酸酯类化学物质，会对人体的生殖、免疫、消化系统带来危害。环氧脂肪酸甲酯作为一种新型的高分子材料助剂，对人体无毒无害，其极性部分（包括酯基和环氧基团）可与聚氯乙烯（PVC）的极性部分相互作用，其非极性部分（直链烃基）介入PVC材料分子链间，削弱了分子链间的应力，从而增加了分子链的移动性、降低了分子链的结晶度，使PVC的塑性增加[22-23]。

3 结 论

经过过氧化处理后中链脂肪酸（MCFA）的纯度达到67.7%，提取率为850%。纯度比原酥油提高10倍左右。过氧化的最佳比值为脂肪酸/过氧乙酸1:3，两次络合条件为脂肪酸与尿素比值为1:3，支链脂肪酸（BCFA）纯度达到15.91%，比原酥油提高5倍左右，得率为21.57%。此外还获得纯度较高的环氧脂肪酸甲酯，相对含量达到11.59%。根据结果表明，经过过氧化处理可有效提高酥油中的MCFA纯度，并获得新的中间产物环氧脂肪酸甲酯，具有一定研究意义，结合尿素络合工艺也可有效提高BCFA纯度，为牦牛乳制品的进一步开发利用提供新的理论依据。