Box-Behnken中心组合设计优化复合奶酒发酵工艺

江宇琪，王琪，刘琨毅，赵金松，吴冬梅

(1.宜宾职业技术学院五粮液技术学院，四川宜宾644003；2.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；3.泸州职业技术学院白酒学院，四川泸州646005)

0 引 言

目前，市面上大部分的乳酒都是以马奶或羊奶为原料，以开菲尔粒或酵母菌与乳酸菌的混合菌为发酵剂，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆浆与马奶或羊奶相比，含有较为丰富的植物蛋白质及营养物质，是马奶或羊奶理想的替代品，也是近年来研究的热点[9-11]。豆浆酒作为一种含有酒精的复合饮料，与传统的乳酒相比，其特点是含有丰富的植物蛋白和豆乳的其他营养成分，既补充了我国居民因牛乳等动物蛋白摄入不足的缺陷，又比传统的乳酒口感更加柔和[12-14]。虽然豆浆酒酒体风味独特、口感柔和，但是其香味不够丰满浓郁进而影响豆浆酒整体的感官特性[14－15]。

复合型发酵酒是使用两种或两种以上的酿酒原料发酵而成的酒品，其能综合两种或两种以上原料的特点与优势，弥补利用单一原料酿酒在色、香、味上的欠缺和营养成分不足等缺陷[16－17]。因此，本试验采用牛奶与豆浆混合发酵酿造，通过优化其发酵工艺条件，以期酿出的酒体风味优雅、口感幼滑、酸度适中的复合奶酒，为后续工业化生产提供一定的理论基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

酿酒酵母，大豆、牛奶、白砂糖，冰乙酸（分析纯），乙酸钠（分析纯），柠檬酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯），亚硫酸钠（分析纯），硫酸铜（分析纯），酒石酸钾钠（分析纯），次甲基蓝。

1.2 仪器与设备

豆浆机（JYL-C91T型），超净工作台（SW-CJ-2FD型），电子天平（FA20043型），低速大容量多管离心机（LXJ-IIB型），隔水式恒温培养箱（MC-GNP-9080型），不锈钢手提式灭菌器（DSX-280A型），电冰箱（BCD-2HBSA型），精密pH计（PHs-3c型），酒精度测试仪（AT6000型）。

1.3 复合奶酒酿造工艺流程

复合奶酒酿造工艺流程为

操作要点：挑选颗粒成熟饱满的大豆，去除其中的杂质，清水洗净后用5倍质量的清水浸泡9~12 h；将浸泡好的大豆按1∶10的质量比加水磨浆后根据单因素试验及响应面试验的条件添加牛奶并煮沸，添加不同浓度的白砂糖并用柠檬酸溶液调pH值到5.0后添加0.02%的亚硫酸钠，以抑制杂菌的生长；在无菌条件下接入一定量的经活化后的酵母菌悬液，25℃发酵，待发酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 方法

1.4.1 理化指标测定方法

总糖（以葡萄糖计）测定采用斐林试剂法[18]，酒精体积分数测定采用密度瓶法[18]，总酸测定采用电位滴定法[18]，氨基酸态氮测定采用甲醛滴定法[18]。

1.4.2 感官评价

感官评价在学院食品品评室内完成，邀请13位教师及实验员组成评定小组，明确感官评定的指标和注意事项。参照王璐等人对马奶酒发酵条件的研究[6]、符桢华等人对豆浆酒的研究方法[13]及GB/T 2354-2009标准[18]对复合奶酒从色泽（满分5分）、组织形态（满分5分）、香气（满分30分）、滋味（满分40分）、典型性（满分20分）5个方面制定复合奶酒感官评价标准，如表1所示。

1.4.3 单因素实验

白砂糖添加量对复合奶酒发酵效果的影响：将豆浆与牛奶按照1∶1的体积比混合后煮沸，分别加入6%，12%，10%，12%，14%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入0.3%经活化后的酵母菌，25℃发酵5 d后分别记录复合奶酒的感官特征，以确定较佳的白砂糖添加量。

物料比对复合奶酒发酵效果的影响：将豆浆与牛奶分别按照3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3的体积比混合后煮沸，并添加质量分数为10%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入质量分数为0.3%经活化后的酵母菌，25℃发酵5 d后进行感官评价，以确定较佳的物料比。

表1 复合奶酒评分细则

接种量对复合奶酒发酵效果的影响：将豆浆与牛奶按照1∶1的体积比混合后煮沸，并添加质量分数为10%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后分别接入质量分数为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%经活化后的酵母菌，25℃发酵5 d后分别进行感官评价，以确定较佳的酵母菌接种量。

发酵时间对复合奶酒发酵效果的影响：将豆浆与牛奶按照1∶1的体积比混合后煮沸，并添加质量分数为10%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入质量分数为0.3%经活化后的酵母菌，在25℃的条件下分别发酵3，4，5，6，7 d并进行感官评价，以确定较佳的发酵时间。

1.4.4 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，根据Box-Benhnken[19]的中心组合试验设计原理，进行四因素三水平的响应面分析实验，确定复合奶酒最佳的酿造工艺条件，因素水平如表2所示。

1.5 数据分析处理方法

以上每个试验重复3次，结果取平均值。采用OriginPro 9.1软件进行数据制图和统计分析。Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 白砂糖添加量对复合奶酒感官评分的影响

控制处理条件为物料比（豆浆∶牛奶）1∶1（体积比）、接种量0.3%、发酵时间5 d，考察在白砂糖添加量质量分数分别为6%，8%，10%，12%，14%时复合奶酒的感官评分，结果如图1所示。

图1 白砂糖添加量对复合奶酒感官评分的影响

图1中，不相同字母表示差异显著（P<0.05），下同。由图1可以看出，当复合奶酒中白砂糖添加量从6%增加到10%，复合奶酒的感官评分也随之增加；当添加量达到10%时，复合奶酒的感官评分达到最高分（76.25±0.87）分。但随着白砂糖添加量的继续增加，复合奶酒的感官评分开始呈现出逐渐下降的趋势。可发酵性糖在复合奶酒发酵过程中主要转化为乙醇，也可以转化成酸类、酯类、醛类等物质[14]。复合奶酒在发酵过程中，可发酵性糖偏少会出现酒体不丰满、香味不足的现象，而可发酵性糖过多则会造成酒体酸度偏大等不良现象。故选用白砂糖添加量为8%，10%及12%用于后续响应面法实验。

2.1.2 物料比对复合奶酒感官评分的影响

由图2可以看出，豆浆能显著改善牛奶酒的风味特征，不仅能有效降低牛奶酒的酸度，而且能赋予牛奶酒独特的风味。复合奶酒的感官评分随着复合奶酒原料中牛奶比例的增加而呈现出先增高后降低的趋势，当物料比（豆浆∶牛奶）为1∶2（体积比）时，复合奶酒的感官评分达到最高的（83.52±0.77）分。因豆浆比例过大会造成复合奶酒香味较寡淡、豆腥味突出等不良特征，豆浆比例偏低又会使复合奶酒出现较高的酸度，因此当豆浆与牛奶比例适当时才能赋予复合奶酒特殊的风味及克服奶酒与豆浆酒的缺陷。由此选择物料比（豆浆∶牛奶）为1∶1，1∶2，1∶3作为后续响应面实验的因素水平。

2.1.3 接种量对复合奶酒感官评分的影响

由图3可以看出，随着酵母菌接种量的不断增加，复合奶酒的感官评分也随之不断增加。当酵母菌接种量为0.5%时，复合奶酒的感官评分达到最高的（76.68±1.04）分。酵母菌在发酵过程中能将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生其他一些醇、醛、酸、酯等香味物质[13]。当酵母菌接种量偏低时，容易使酿酒原料不能完全发酵，造成复合奶酒酒度偏低、酒香不突出等现象。当酵母菌的接种量为0.3%与0.4%时，其复合奶酒的感官评分虽然较酵母菌接种量为0.5%时低，但三者并无显著性差异（P>0.05）。所以选择酵母菌接种量为0.2%~0.4%用于响应面法试验。

图2 物料比对复合奶酒感官评分的影响

图3 接种量对复合奶酒感官评分的影响

2.1.4 发酵时间对复合奶酒感官评分的影响

控制处理条件：白砂糖添加量质量分数10%、物料比（豆浆∶牛奶）1∶1（体积比）、接种量0.3%，分别考察发酵时间为3，4，5，6，7 d时复合奶酒的感官评分，结果如图4所示。

图4 发酵时间对复合奶酒感官评分的影响

由图4可以看出，复合奶酒的感官评分随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间为7 d时，复合奶酒的感官评分达到最高的（83.11±0.67）分。虽然复合奶酒的感官评分在其发酵6 d时较发酵7 d时偏低，但二者并无显著性差异（P>0.05）。当发酵时间少于5 d时，醪液中的可发酵性糖还未完全被酵母菌所利用，酒体略显寡淡，乙酸乙酯等酒香物质含量偏低，使得复合奶酒的酒香不够浓郁。因此选择发酵时间为5，6，7 d用于后续试验。

2.2 响应面法实验

根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，通过Design Expert 8.0.6软件设计响应面法试验，对白砂糖添加量、物料比（豆浆∶牛奶）、接种量、发酵时间4个因素分析得到以下试验方案及结果如表3所示。

表3 响应面试验设计及结果

再通过Design-Expert 8.0.6软件对响应面法试验得到的感官评分（见表3）进行方差分析，得到结果如表4所示。

由表4可以看出，4个因素对复合奶酒感官评分影响的强弱顺序依次为：接种量>发酵时间>物料比>白砂糖添加量，其中接种量对复合奶酒感官评分的影响显著（P<0.05）。物料比与接种量之间具有极为显著的交互作用（P<0.01）。设白砂糖添加量、物料比、接种量、发酵时间分别为A，B，C，D；以复合奶酒的感官评分为响应值，经多元回归拟合后，得到复合奶酒感官评分回归方程：复合奶酒感官评分=82.33-0.35A+0.46B-0.98C+0.62D+0.33AB+0.43AC-0.94AD+2.82BC+1.41BD-0.067CD-3.12A2-2.50B2-3.29C2-4.17D2。

根据表4中方差分析结果，复合奶酒感官评分的回归方程描述与响应面值之间的关系模型显著（P<0.05），且失拟项检验不显著（P>0.05），表明未知因素对实验结果的干扰较小，该试验模型充分拟合试验数据，复合奶酒感官评分的回归方程是复合奶酒感官评分与复合奶酒发酵工艺各参数的合适数学模型，即可以利用此回归方程确定复合奶酒酿造的最佳工艺[20]。

表4 方差分析

响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[21]。根据复合奶酒感官评分回归方程得出不同因子的响应面分析图结果如图5所示。

由响应面图曲面坡度越陡峭、等高线越密集成椭圆形表示两因素交互影响越大的原则[20-22]可知，因子B（物料比）与因子C（接种量）之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭即因子B与因子C相互之间具有最强的交互作用。该结果与表4方差分析所得的物料比与接种量之间具有极为显著的交互作用（P<0.01）的结论相吻合。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析确定复合奶酒的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量9.84%、物料比（豆浆：牛奶）1∶2.04（体积比）、接种量0.29%及发酵时间6.09 d，此条件下由公式算出的理论值为86.32分。根据所得的分析数据进行3组验证试验，验证试验的条件为白砂糖添加量9.8%、物料比（豆浆∶牛奶）1∶2（体积比）、接种量0.3%及发酵时间6.1 d，得到复合奶酒的感官评分为（86.07±1.04）分，测定结果稳定，偏差不大，证明该结果合理可靠。

2.3 理化指标分析

经测得复合奶酒在最佳发酵工艺条件下的总糖为11.6 g/L、酒精体积分数5.3%，总酸质量浓度7.9 g/L，氨基酸态氮质量浓度0.24 g/L。4种理化指标均符合中华人民共和国GB/T 2354-2009标准[18]。

图5 两因素交互作用对感官评分的响应面

3 结 论

在单因素实验的基础上采用响应面法对复合奶酒的发酵工艺条件进行了优化，影响复合奶酒感官评分的工艺因素按主次顺序排列为接种量>发酵时间>物料比>白砂糖添加量。最终确定了其最优工艺条件为：将浸泡好的大豆按1∶10的质量比加水磨浆后按照物料比（豆浆：牛奶）1∶2（体积比）加入牛奶煮沸，加入质量分数为9.8%的白砂糖并用柠檬酸溶液调pH值到5.0后添加0.02%的亚硫酸钠，在无菌环境条件下接入0.3%经活化后的酵母菌悬液，在25℃条件下发酵6.1 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此条件下可获得色泽微黄透明、奶香与酒香和谐、酒体丰满圆润的复合奶酒，其感官评分为86.07分。若需将此复合奶酒进行工业化生产还需对酒体进一步勾调及澄清处理，使其感官特性符合商品要求。