活血益心方对大鼠缺血再灌注心肌损伤的保护作用

于艳波 刘占军 芦珊

(1吉林大学第二临床医院临床技能培训中心，吉林 长春 130062；2长春生物制品研究所有限责任公司；3吉林大学第二临床医院老年病科)

缺血性心脏病是人类最常见且危害严重的疾病之一，心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常见的病理过程。目前临床治疗采用动脉搭桥、溶栓疗法、冠脉介入等手段,可以使缺血心肌恢复血流供应,减少坏死和控制梗死面积进一步扩展。多数情况下，缺血后再灌注可修复损伤组织、脏器，恢复患者生命健康，但部分患者缺血心肌在恢复血液再灌注后，会诱发一系列的功能、结构、代谢及心肌细胞电生理特性等各个方面的损伤进一步加重的现象〔1〕，不仅不能恢复组织器官功能，反而加重脏器的结构损伤与功能障碍，即心肌缺血再灌注损伤。因此，保护缺血心肌、减少再灌注损伤显得尤为重要。活血益心方具有活血祛瘀、宣痹止痛的功效，本研究通过对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的研究，进一步观察其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠，体重230～250 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK-(吉)2016-0004。

1.2药物与试剂 活血益心方,吉林中医药大学制剂室制备提供,批号：20160325；丹蒌片，吉林康乃尔药业有限公司生产，批号：20160307；乌来糖，国药集团化学试剂有限公司，批号：T20160310；丙二醛(MDA，批号：20161029)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：20161026)、游离脂肪酸(FFA，批号：20161031)、一氧化氮(NO，20161011)测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所生产；天门冬氨酸氨基转移酶(AST，批号：160961)、乳酸脱氢酶(LDH，批号：160430)、肌酸激酶(CK，批号：160901)测定试剂盒，均为中生北控生物科技股份有限公司生产；谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、三磷酸腺苷酶(ATP，包括Ca2+-Mg2+-ATP、 Na+-K+-ATP)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、内皮素(ET)、白细胞介素(IL)-1、IL-6测定试剂盒，批号：E20160901A，均为美国RB公司产品。

1.3仪器 PowerLab/8sp型多导生理记录仪，澳大利亚；HX-100E型小动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司生产；GF-D800型半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司生产；ST-360型酶标仪，上海科华实验系统有限公司生产。

1.4方法

1.4.1分组及给药 雄性Wistar大鼠60只(每组10只)，按体重随机分为正常对照组，模型组，丹蒌片组(964 mg/kg)，活血益心方高(12.0 g生药/kg)、中(6.0 g生药/kg)和低剂量(3.0 g生药/kg)组。每天分别灌胃给药1次，对照组和模型组灌胃给予相同体积的蒸馏水，各组动物灌胃容积均为10 ml/kg，连续给药10 d。

1.4.2模型制备 末次给药(给药第10天)1 h后，腹腔注射(ip)以生理盐水配制的1.2 g/kg、10 ml/kg乌来糖溶液将动物麻醉，剥离气管，连接小动物呼吸机，并于左侧第3、4根肋骨处开胸，待呼吸稳定后，用拉钩将肋骨拉开，暴露心脏，用4号手术线结扎左冠状动脉前降支(左心耳下1 mm处)，后迅速将心脏轻推回胸腔，在结扎时结扎扣底垫1 cm长硅胶管(输液器前段硅胶管1 cm)，结扎30 min后剪开结扎点〔2〕，进行再灌注，观察120 min。记录正常、开胸后、结扎后、再灌注120 min心电图；空白对照组只穿线不结扎。

1.4.3观察指标 试验结束腹主动脉采血，离心分离血清，检测血清CK、LDH、AST、MDA、SOD、GSH-PX、FFA、NO、ET、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP活性或含量；取心肌，检测Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP含量。同时每只动物取心脏同一部位，以10%甲醛固定，HE染色，做病理组织学检查。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1对缺血再灌注损伤模型大鼠血中心肌酶的影响 与对照组相比，模型组血中心肌酶活性异常增高(P<0.01，P<0.001)，而活血益心方高剂量组能明显降低CK、LDH、AST酶活性(P<0.05)；丹蒌片可明显降低CK、LDH酶活性(P<0.05)。见表1。

2.2对缺血再灌注损伤模型大鼠血中自由基的影响 与对照组相比，模型组血中SOD、GSH-PX活性明显降低、MDA含量异常增高(P<0.05，P<0.001)，而给予活血益心方和丹蒌片后，可明显纠正这种异常变化。活血益心方各剂量组均能明显增强SOD活性(P<0.01，P<0.001)；活血益心方高剂量组、丹蒌片组明显降低MDA含量(均P<0.05)；活血益心方高剂量组、丹蒌片组能明显增强GSH-PX活性(P<0.01，P<0.05)。见表1。

表1 活血益心方对缺血再灌注损伤模型大鼠血清CK、LDH、AST活性及自由基的影响

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.001，3)P<0.05；与模型组比较：4)P<0.05,5)P<0.01,6)P<0.001，下表同

2.3对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌及血中能量代谢的影响 与模型组比较，丹蒌片组、活血益心方高、中剂量组能明显增强心肌Ca2+-Mg2+-ATP活力(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，活血益心方高剂量组及丹蒌片组可明显增强心肌Na+-K+-ATP活力(P<0.01，P<0.05)；活血益心方各剂量组可明显降低血中FFA含量(均P<0.01)；丹蒌片组对血中FFA含量无明显影响(P>0.05)。见表2。

表2 活血益心方对缺血再灌注损伤大鼠心肌Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K+-ATP活力及FFA含量的影响

2.4对缺血再灌注损伤模型大鼠血中血管影响因子的影响 与对照组相比，模型组血中ET含量明显升高(P<0.01)，NO含量明显降低(P<0.001)，而活血益心方中、高剂量组和丹蒌片组均能明显降低血中ET含量(P<0.01、P<0.05)；活血益心方低、中、高剂量组和丹蒌片组均能明显增加血中NO含量(P<0.01、P<0.05)。见表2。

2.5对缺血再灌注损伤模型大鼠血中炎症因子的影响 与对照组相比，模型组血中炎症因子发生异常改变(P<0.05、P<0.01)，而活血益心方高剂量组、丹蒌片组均能明显降低血中炎性递质IL-1含量(P<0.05，P<0.01)；活血益心方各剂量组和丹蒌片均能明显降低血中CRP、IL-6、TNF-α含量(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。见表3。

表3 活血益心方对缺血再灌注损伤模型大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量的影响

2.6对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌病理的影响 通过病理组织形态学观察，结果显示模型组与对照组比较，可见心肌细胞变性，心肌纤维断裂，心肌细胞间隙明显增宽，炎细胞浸润，而给予活血益心方及丹蒌片后，心肌细胞变性及炎细胞浸润不同程度减轻，心肌损伤得到明显改善。见图1。

图1 各组心肌组织病理观察(HE，×400)

3 讨 论

心肌缺血/再灌注损伤是急性心肌梗死、冠心病等缺血性疾病常见的病理过程，其机制与氧自由基的生成、细胞内钙离子超载、炎症因子释放等因素有关〔3〕，严重威胁着人类的身心健康。心肌缺血后,心肌细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤之间有一个演变过程,这与心肌缺血程度有关，在一定时间内,缺血心肌的损伤是可逆的。虽然早期、及时再灌注心脏是防止心肌组织缺血造成进一步损害的有效方法，但缺血组织恢复血流灌注时，往往导致再灌注区域心肌细胞及局部血管显著的病理变化，而这些改变的共同作用可导致进一步的组织损伤。近年来中药治疗心肌缺血取得了一定的进展，其特点为疗效高、毒副作用小，在临床应用中起着重要作用。活血益心方是以中医临床实践为基础研制出的中药复方制剂，对痰瘀互阻所致的冠心病、心绞痛具有很好的疗效。本研究采用缺血再灌注心肌损伤模型，观察活血益心方对缺血再灌注心肌损伤的保护作用。

心肌缺血再灌注损伤的机制较复杂，可造成心脏形态及功能方面的改变，因此，可通过心电图、组织学和生化酶学等多项指标的检测进行综合判定分析〔4〕。心肌酶的释放量是心肌损害程度的一个主要标志，在一定程度上反映心肌病变程度。正常情况下心肌酶存在于心肌细胞的胞质中，在维持心肌正常生理功能方面发挥着重要作用，当心肌发生缺血、梗死或再灌损伤时，心肌受损导致心肌细胞损伤严重，甚至坏死、破裂，使细胞膜的通透性升高，大量的CK、LDH等被心肌细胞释放到血中，使血液中的酶含量显著升高，活性急剧增强，进而加重对心肌的损伤〔5,6〕。而活血益心方能明显抑制再灌注损伤动物血清CK、AST及LDH活性，表明活血益心方对心肌缺血再灌注损伤具有明显保护作用。

当发生心肌缺血再灌注时，不仅氧自由基生成增多，而且机体对自由基的清除能力减低，从而造成氧自由基大量蓄积，引起心肌组织的严重损伤。MDA是自由基与细胞膜上多不饱和脂肪酸反应生成的脂质过氧化物，可反映体内脂质过氧化情况，间接地反映自由基攻击的严重程度,其含量高低反映了氧自由基在细胞内的生成水平及其对细胞的损伤程度；SOD是体内清除自由基的主要成分，其活力可反映机体清除氧自由基的能力；GSH-PX是机体的内源性抗氧化物酶，反映机体的抗氧化能力。因此可以通过MDA含量及SOD、GSH-PX活性变化评定心肌缺血的程度及药物作用机制〔7〕，试验结果表明，活血益心方可以明显降低血清MDA含量，显著升高血清SOD、GSH-PX酶活性，说明活血益心方可以通过降低血清MDA含量，增强SOD、GSH-PX活性，使自由基代谢紊乱情况得以纠正，从而维持机体氧化及抗氧化系统的动态平衡, 减少自由基的毒副作用, 进而降低对心肌的损伤来保护心肌。

研究表明，在心肌缺血再灌注过程中，炎症因子贯穿于心肌损伤的全过程，随着再灌注的进行，大量活化的中性粒细胞聚集在心肌微血管并浸润到心肌组织中，通过释放细胞炎性物质引起心肌损伤，IL-1、IL-6和TNF-α、CRP作为重要的炎症细胞因子在缺血再灌注损伤中被广泛地关注。心肌细胞在缺血再灌注的刺激下可合成和分泌大量 TNF-α，TNF-α能诱发炎症反应诱导白细胞聚集，促进IL-1、IL-6等炎症介质产生和释放〔4，8，9〕；炎症细胞含有CRP受体，感染和创伤等应激反应时，血清CRP含量迅速升高，CRP的大量产生并活化炎症细胞，进而诱导炎性反应发生，通过直接(浸润、聚集)或间接(产生细胞因子)作用，引起血管内皮受损，使炎症反应进一步增强，促进了心肌缺血再灌注损伤〔10〕。本研究表明，活血益心方可以抑制心肌缺血再灌注时炎性递质激活，从而保护心肌缺血再灌注损伤。

NO是血管内皮细胞分泌的最重要的舒血管因子，具有舒张血管、抑制血小板凝聚、减轻炎症反应等保护血管内皮细胞的作用〔11〕。ET是一种血管活性肽，具有强烈、持久的缩血管作用和促神经内分泌的作用。正常情况下，ET和NO处于动态平衡之中，对血管弹性进行动态调节，维持冠状动脉各分支血管的舒缩功能。再灌注损伤时，血管内皮细胞受损导致内源性NO合成减少,使NO功能降低失活，NO和ET间平衡失调，导致血管舒缩功能紊乱及通透性改变，加剧心肌损伤。因此，纠正NO、ET的失衡对缺血心肌组织的保护将起积极的作用。活血益心方能明显升高心肌再灌注损伤大鼠血清NO含量，显著降低ET含量，表明活血益心方具有调节血管活性物质NO、ET的分泌的功能，从而达到拮抗心肌缺血再灌注损伤、对心肌损伤起到保护作用。

心肌缺血后再灌注易导致心肌发生严重的功能紊乱，其中钙超载是重要的机制之一。ATP酶在心肌维持生理功能中发挥着极其重要的作用, 是心肌细胞活动的物质基础。心肌缺血再灌注发生时,心肌细胞内能量代谢出现障碍，ATP合成量明显下降，ATP酶(包括Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶等)活性随之下降〔6〕，这两种酶活性发生改变，必将引起胞质内Ca2+水平失调，从而产生各种病理变化，进一步导致心肌细胞钙超载和能量代谢障碍。活血益心方可有效地促进Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的恢复，抑制细胞内Ca2+超载，从而降低缺血再灌注损伤的程度。

心肌梗死时，FFA水平增高，随着心肌利用脂肪酸供能增加，脂质中间代谢产物大量堆积，过多活性氧产生，损害线粒体，从而引起心脏收缩、舒张功能异常，增加心肌耗氧量，而加重心肌缺血，扩大缺血或梗死范围，加重心肌的缺血损伤坏死,促进心律失常发生，甚至猝死〔12〕。本实验结果表明，心肌缺血再灌后，FFA水平急剧升高，而活血益心方可明显抑制FFA水平升高，从而保护心肌。综上所述，活血益心方能有效减轻心肌病变程度，改善心肌酶活性和能量代谢，对抗自由基损伤，激活血管活性物质，抑制炎症反应发生，保护和稳定心肌细胞，对缺血再灌注损伤心肌具有一定的保护作用。