新一代微测序基因芯片的设计及其耐药性检测效果的初步研究

孙照刚 张洪静 李自慧 孙琦 吕琳娜 潘丽萍 Sandy Gilbert 张宗德 许绍发 James Xia

结核病，尤其是耐药结核病的快速和全面诊断需求迫切。目前，结核病的分子生物学药物敏感性试验(简称“药敏试验”)技术有了长足的发展，诸如线性探针技术、GeneXpert MTB/RIF技术、熔解曲线检测技术及芯片检测技术相继出现。耐药结核病基因芯片检测是WHO认可的用于结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测的分子生物学方法[1]。包括我国在内的多个国家和地区研发了不同的MTB耐药检测基因芯片[2-5]。目前，用于MTB耐药性检测的基因芯片基本都是基于核酸杂交原理的第一代基因芯片技术。本研究将报道具有快速、方便和精准等特点的新一代基于微测序原理的基因芯片技术。

材料和方法

一、实验材料

1.菌株来源：MTB实验室标准菌株(H37Rv)和109株临床分离菌株均来自于北京结核病临床数据和样本资源库。

2.仪器和试剂：(1)主要仪器：普通PCR仪(杭州博日科技有限公司)、原位PCR仪(杭州博日科技有限公司)、芯片扫描仪[Agilent G5761A；安捷伦科技(中国)有限公司]等。(2)主要试剂：Dnase Ⅰ(美国Sigma公司)、测序酶(美国GE Healthcare公司)、Biotin-NTPs(美国Life Sciences公司)、Streptavidin-Alexa 647粉末(美国Life Sciences公司)等。

二、实验方法

1.表型药敏试验：MTB临床分离株的培养采用改良罗氏培养基培养法，用MTB标准菌株(H37Rv)进行质量控制。药敏试验采用绝对浓度法，试验药物为异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(Ofx)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)，试验浓度：INH 1、10 μg/ml；RFP 50、250 μg/ml；Sm 10、100 μg/ml；EMB 5、50 μg/ml；Ofx 2、10 μg/ml；Am 30、100 μg/ml；Cm 40、100 μg/ml[6]。

2.DNA提取：采用基因组DNA小量提取试剂盒(德国凯杰公司)，按照操作说明书对复苏培养的菌株进行溶菌酶消化菌体和蛋白酶K消化组蛋白等杂蛋白步骤，最后采用核酸吸附柱将基因组DNA吸附在柱子的膜上，最后用水洗脱用作PCR反应模板。为了便于验证临床菌株中稀有出现的密码子突变，笔者还设计合成了17个包含MTB基因组稀有突变的质粒。

3.PCR扩增和序列测定：根据文献[7]报道的PCR所用的引物和条件进行耐药基因的PCR扩增。PCR产物的测序采用每个基因单独扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。用于芯片检测的PCR产物根据文献[7]采用两管扩增8个基因的方法进行多重PCR测定。采用PCR产物纯化试剂盒(德国凯杰公司)纯化PCR产物，按照说明书进行。

4.芯片的设计和制备：根据笔者获得批准的专利(批准号：201510033001.0)设计相应的芯片。首先根据待检测的突变位点和形式在突变两侧设计反向和正向探针序列，并进行探针合成；之后，将探针的5′端固定在固相介质——玻璃生物芯片上，3′端终止在基因多态性位点。如果与被检测目标位点发生错配，引物就不会延伸扩增，如果恰好能够与被检测目标位点吻合则引物扩增会顺利进行，从而显示荧光信号。

5.芯片检测：(1)PCR产物酶解：取0.2 μl DNase Ⅰ工作液(0.1 U/μl)，加入到20 μl所有 PCR纯化产物的混合物中，37 ℃处理10 min，95 ℃处理10 min。(2)芯片检测：将chamber胶面与芯片正面贴合在一起，放入平板扩增仪中，90 ℃处理2 min。将含有生物素标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)、测序酶和PCR混合产物的芯片反应液从加样孔中注入芯片槽内，采用85 ℃退火和60 ℃延伸反应的条件循环扩增8次。芯片反应结束后，从基因扩增仪中取出芯片，置于60 ℃芯片洗涤液中，保持芯片正面向上，在洗涤液中洗涤30 min。之后在超纯水中，室温洗涤3次。将芯片置于Streptavidin-Alexa 647染色液染色，重复脱色，最后加入超纯水继续洗涤2次，甩干后进行全芯片扫描。

6.芯片结果的判读：本研究是创新性探索研究，没有相应的数据结果处理软件，故而采用人工计算的方法。在同一张芯片的随机物理位置上点制同一种检测探针，因此每个标本可被重复检测3次，计算平均值。阳性标本的荧光值是阴性标本(或者对照水标本)荧光值的2倍以上即判断为阳性。以测序结果为标准，计算芯片检测结果的符合率，计算公式：与测序结果相同的芯片检测标本数量/该位点总的检测标本数量×100%。对于同一个基因存在多个位点的不同突变形式，只要有1个判断为突变阳性，则定义为该基因检测阳性。

三、统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。以测序结果为标准，计算芯片检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和一致性。两种方法的一致性用Kappa检验，K<0.4,认为一致性较差；0.4≤K<0.75，认为一致性一般；K≥0.75，认为一致性较好。

结 果

一、耐药基因序列测定

109株MTB临床分离株各耐药基因的突变形式和数目见表1。所有经表型药敏试验确定为相应抗结核药物耐药的菌株在本研究中检测的耐药相关基因中均存在至少1个有义碱基突变。

表1 109株MTB临床分离株的耐药相关基因突变情况

续表1

注表中C、T、A、G分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的缩写。a:表示尚未找到适合的突变检测探针

二、微测序耐药基因芯片探针的整体设计

在前期验证探针设计和芯片检测正确的基础上，进一步设计包括katG、inhA启动子区、rpoB、gyrA、embB、rpsL、rrs和eis基因的目前已报道的所有突变位点的全部已知突变形式，共计220条探针。其中，包含katG基因2个碱基位点的4种突变形式，inhA启动子区2个位点的2种突变形式，rpoB基因的7个位点的14种突变形式，gyrA基因的6个位点的9种突变形式，embB基因7个位点的16种突变形式，rpsL基因3个位点的6种突变形式，rrs基因3个位点的4种突变形式，eis基因3个位点的3种突变形式。经过在35株MTB临床分离株和突变合成质粒中初步的基因芯片探针验证，确定了其中67条效果较好的探针作为进行MTB耐药突变检测的最终基因芯片探针组合。但是仍然有6种突变形式需要进一步优化其探针，这些探针分别用来检测eis基因的-14位点、gyrA基因94位点(GAC)的AAC和TTC突变形式和embB基因306位点(ATG)的GTC、TTA和AGC突变形式。

三、微测序耐药基因芯片各探针的检测效果

基于前期筛选到的优秀突变检测探针，制备了包含有67条探针的MTB耐药突变检测基因芯片，检测的突变位点和突变形式见表2。本研究初步对109株临床分离株采用该芯片进行了突变检测，检测结果证明：除检测embB基因突变的2条探针(embB_1489-90_S_CA和embB_916-8_A_CAT)外，与测序结果相比，其余65条探针在检测碱基突变形式方面的符合率均超过了95%，其中42条探针的检测结果与测序结果符合率达到了100.00%。

表2 选择出的67条探针检测109株MTB临床分离株相应耐药位点的碱基突变情况

续表2

注a：表示109株MTB临床分离株中未发现相应的突变。探针名称命名原则为：基因名称_突变位点_正(S)反(A)向_碱基，例如：eis_-10_S_G，表示在eis基因的-10位点(启动子区)的正向检测碱基G的探针；而embB_126-8_A_TCG则表示在embB基因126～128位点上检测3个碱基TCG的反向探针(正向序列为CGA)；“符合率”指基因芯片检测结果与表1中的测序结果相比所能达到的符合率

四、总体耐药基因突变检测效果分析

表2列出的是每个耐药突变位点的检出情况，涉及MTB的8个耐药相关基因。由于每个基因涉及多个耐药突变位点的检测，只有将表1中同一耐药相关基因的所有突变位点进行整体描述才能判断本研究设计的芯片在基因水平上的检测效果。分别以每个耐药基因作为一个整体来看，以测序结果为参照标准，基因芯片检测对embB基因、gyrA基因、inhA基因、katG基因、rpoB基因、rpsL基因、eis基因和rrs基因突变检测的敏感度分别为64.21%(61/95)、80.00%(8/10)、95.83%(23/24)、98.55%(68/69)、92.63%(88/95)、93.85%(61/65)、75.00%(3/4)和94.44%(17/18)；特异度分别为92.86%(13/14)、100.00%(99/99)、97.65%(83/85)、87.50%(35/40)、85.71%(12/14)、63.64%(28/44)、100.00%(105/105)和98.90%(90/91)。基因芯片检测gyrA基因、inhA基因、katG基因、eis基因和rrs基因的效能与基因测序具有高度的一致性；检测rpoB基因和rpsL基因的效能与基因测序的一致性中等；检测embB基因的效能与基因测序的一致性一般(表3)。

讨 论

耐药结核病的快速诊断和高通量诊断是目前技术研发的方向和趋势。目前较为成熟的MTB快速耐药检测技术是GeneXpert MTB/RIF技术。典型的高通量耐药检测技术当属基因芯片技术[8]。受传统芯片杂交检测法的技术限制，目前的耐药基因芯片检测的只有INH和RFP两种药物，检测的药物种类不多，未能充分发挥基因芯片检测的优势[9]。因此，笔者课题组研究和开发了新一代耐药基因芯片检测技术——微测序基因芯片。该技术类似于在芯片的原位位点上进行测序，因此具有快速和精准的特点和优势。

基因芯片用于结核病的检测已经显示出较高的临床应用价值，主要的应用领域集中在MTB的耐药性检测和菌种鉴定方面。其基本检测原理是检测MTB的单核苷酸多态性位点(SNP)。基因芯片通过检测MTB抗结核药物耐药相关基因的碱基突变来确定其耐药性[10]；利用各分枝杆菌菌种之间高度保守的DNA同源序列具有一定程度的序列差异的特点进行菌种鉴定，检测的靶基因主要包括16S核糖体DNA(16S rDNA)转录间区序列(internal transcribed spacer, ITS)、热休克蛋白65(hsp65)、RNA聚合酶亚基(rpoB)等同源序列[11-15]。基因芯片检测存在操作程序略显复杂和所需设备昂贵等缺点，加之检测标本中非结核分枝杆菌感染所占比例较低，因而菌种鉴定芯片的使用目前尚没有被广泛采用。在我国，基因芯片已经较为广泛地应用于MTB耐药性检测，在多种类型结核病检测中得到应用，如初治和复治肺结核[16]、尘肺并发肺结核[17]和骨结核[18]等。因此，笔者首先将微测序基因芯片技术用于耐药结核病的检测领域。

表3 以基因测序结果为参照标准基因芯片检测MTB耐药基因突变的检测效能

注表中括号内数值为“95%CI值”

本研究首先采用少量MTB基因突变位点进行芯片的设计和确立检测流程，结果显示，初期设计的微测序耐药基因检测芯片具有很好的检测效果，与测序结果一致。进一步对8个基因的所有突变形式进行探针设计，经过探针的优化和筛选后，最终得到67条探针用于芯片的制备。对制备好的芯片进行验证，结果证明除embB基因外，该芯片具有良好的检测性能，各耐药基因的检出率均达到或超过95%，达到或超过目前应用的耐药基因检测芯片的检出率[2-5]。本研究设计制备的芯片不但容纳了临床分离株中几乎全部突变(包括稀有的耐药基因突变)，而且能够清楚地表明突变位点和突变形式，可以用于精确的科学研究。

为了充分显示微测序芯片的技术优势，本研究对芯片检测结果与测序结果进行了比较，结果显示两者具有高度的一致性。但是靶基因测序的结果发现：在表型耐药的菌株中至少能发现其相关耐药基因中的1个突变位点，表型耐药和基因型耐药显示出高度的一致性。造成这一现象的原因很可能与本研究所选实验菌株有关。为了能够使微测序基因芯片上有足够多的耐药突变形式得到充分验证，降低验证成本，笔者所选实验菌株主要以耐多药MTB为主。但是这并不影响本研究所要达到的目的。同时，本研究也没有对微测序耐药基因芯片的耐药性检测结果与表型药敏试验结果进行比较。

本研究将所有8个基因的所有突变形式进行探针设计，不可避免地出现了个别探针难以找到合适的探针序列的现象。其原因归根结底是由突变碱基位点两侧的核酸序列决定的，但是也可能与该突变位点突变形式多样，而且决定该位点氨基酸的三联体密码子同时发生两个以上的突变有关。因此，在进一步的研究中，对这类联合突变将采用逐个组合的方式进一步优化并得到适合的探针。另外，鉴于基因芯片检测操作流程的复杂性，今后还需进一步优化技术操作流程，缩短检测时间，以便及时为临床提供准确的检测结果。