2017—2018年陕西省涂阳肺结核患者临床分离株的耐药性检测结果分析

杨健 张天华 鲜小萍 李妍 王蕊

结核病是全球第10大致死疾病，2017年全球约有1000万例新发结核病患者，利福平(RFP)耐药结核病患者56万例，其中82%为耐多药结核病(MDR-TB)患者；根据估算我国RFP耐药患者数为7.3万例，占全球新发结核病患者的13%[1]。“十二五”期间，陕西省结核病报告发病率由67.9/10万下降到56.7/10万，降幅为16.8%，初步遏制了结核病疫情的增长势头[2]。来自国家传染病报告信息管理系统和结核病信息管理系统的数据显示：2017年和2018年陕西省结核病报告发病率分别为59.0/10万和55.9/10万，肺结核患者病原学阳性率分别为24.45%和38.62%，细菌学阳性肺结核患者登记率分别为12.3/10万和16.9/10万。结核病耐药性监测是了解耐药结核病的流行现状和趋势，进而制定耐药结核病控制策略的重要手段。2009—2010年在全省首次开展的肺结核耐药性监测结果显示[3]：陕西省耐药率为30.00%，耐多药率为5.94%，RFP耐药率为7.78%，以上数据表明陕西省耐药疫情严重，面临耐多药和RFP耐药的挑战。为进一步了解当前陕西省MTB耐药水平及特点，笔者对2017年1月至2018年12月陕西省26个结核病定点医院涂阳肺结核患者临床分离株的耐药情况进行调查分析，为今后陕西省结核病防治工作提供参考数据。

材料和方法

一、研究对象

以2009—2010年第五轮中国全球基金结核病耐药监测项目在陕西省选取30个县(区)作为耐药监测点的方案为参照，进行整群随机抽样，以市为单位分别对下辖县(区)结核病定点医院进行编号，按照方案中抽取县(区)数所占各市下辖县(区)总数的比例，采用抽签法在全省108个定点医院中共抽取了26家定点医院作为调查点，包括21家县(区)级医院，5家市级医院，其中1家市级医院的菌株来自下辖的4个县(区)，1家市级医院的菌株来自下辖的2个县(区)，26个调查点共覆盖30个县(区)的人口，约占全省人口总数的28.35%(1127万/3976万)。收集2017年1月至2018年12月来自陕西省26家结核病定点医院诊断为痰涂片阳性的新登记初、复治肺结核患者的临床分离株，共收集1085株，其中98株(9.03%，98/1085)传代失败，最终共获得987株临床分离株，约占2017—2018年调查县(区)结核病信息管理系统登记的细菌学阳性肺结核患者总例数的35.43%(987/2786)。 987株分枝杆菌菌株经菌种鉴定，非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria, NTM)为22株，NTM的分离率为2.23%(22/987)。MTB为965株(97.77%，965/987)，其中关中地区356株(西安市198株、渭南市38株、宝鸡市41株、咸阳市45株、铜川市34株)；陕南地区383株(商洛市256株、安康市41株、汉中市86株)；陕北地区226株(延安市135株、榆林市91株)，最终共有965株MTB进行了耐药性检测。

二、实验室检测方法

菌种鉴定采用对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid, PNB)培养基，药物敏感性试验(简称“药敏试验”)采用比例法，各项实验操作均按照《结核病实验室检验规程》[4]的标准化操作程序进行。菌种鉴定培养基中药物终浓度为PNB 500.0 μg/ml。6种抗结核药物在培养基中的终浓度分别为：异烟肼(INH：0.2 μg/ml)、RFP(40.0 μg/ml)、链霉素(Sm：4.0 μg/ml)、乙胺丁醇(EMB：2.0 μg/ml)、氧氟沙星(Ofx：4.0 μg/ml)、卡那霉素(Km：30.0 μg/ml)。罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。药敏试验操作时以标准菌株H37Rv作为对照。H37Rv由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

三、质量控制

涂片检测在各调查点完成，分离培养试验由各调查点和省结核病参比实验室共同完成，菌种鉴定和药敏试验均在省级参比实验室完成。调查点的临床医生和实验室人员均接受过省级或国家级专业培训，保证痰涂片假阳性率及假阴性率在控制范围内，分离培养试验要求污染率<5%、涂阳培阴率<10%。省级参比实验室每年均通过中国疾病预防控制中心开展的抗结核药敏试验室间质量考评。所有数据均在省结核病参比实验室统一进行平行双录入并做一致性核查。

四、耐药定义

耐药率：至少对6种抗结核药物中的1种耐药的菌株占全部药敏试验菌株的百分比；单耐药：仅对1种抗结核药物耐药；多耐药：对1种以上一线抗结核药物耐药(不包括同时对INH和RFP耐药)；耐多药：至少对INH和RFP同时耐药；广泛耐药：在耐多药的基础上，至少同时对1种二线注射类和1种氟喹诺酮类抗结核药物耐药。RFP耐药：对RFP的任何耐药，包括对RFP耐药的上述任何类型。

五、统计学方法

采用Excel 2007软件建立数据库，应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计算各项耐药率、构成比，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法进行统计学检验。以双侧检验α=0.05为界值，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、耐药情况及耐药顺位

1. MTB临床分离株耐药情况：965株MTB的耐药率为28.50%(275/965)，耐多药率为6.53%(63/965)。复治患者的耐药率(44.80%)、耐多药率(20.80%)、广泛耐药率(3.20%)、RFP耐药率(28.00%)均明显高于初治患者的耐药率(26.07%)、耐多药率(4.40%)、广泛耐药率(0.24%)、RFP耐药率(7.14%)，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

2. MTB临床分离株对一、二线抗结核药物耐药情况：对4种一线抗结核药物耐药率为26.01%，对2种二线抗结核药物耐药率为8.50%。复治患者对6种抗结核药物的任一耐药率及对一、二线药物耐药率均明显高于初治患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

3. 耐药顺位：6种抗结核药物耐药顺位依次为Sm(17.62%)>INH(15.03%)>RFP(9.84%)>Ofx(6.84%)>EMB(5.08%)>Km(2.59%)。其中初治耐药顺位依次为Sm(15.48%)>INH(12.74%)>RFP(7.14%)>Ofx(5.36%)>EMB(3.93%)>Km(1.79%)；复治耐药顺位依次为Sm(32.00%)>INH(30.40%)>RFP(28.00%)>Ofx(16.80%)>EMB(12.80%)>Km(8.00%)，初治、复治耐药顺位一致(表2)。

表1 不同耐药类型在初治、复治患者中的分布与比较

注a:初治患者与复治患者比较；b：Fisher确切概率法

表2 一、二线抗结核药物耐药情况在初治、复治患者中的分布与比较

注a:初治患者与复治患者比较

二、耐药谱的构成

275株耐药MTB的耐药谱共有39种耐药组合。其中单耐药6种，以单耐Sm的比例最高，占44.20%。多耐药5种，以INH+Sm的比例最高，占75.00%。耐多药13种(包括广泛耐药3种)，耐多药顺位居前3位的依次为INH+RPF+Sm(22.22%)、INH+RFP+EMB+Sm(17.46%)、INH+RFP+EMB+Sm+Ofx(14.29%)。在含二线药的多耐药菌株中有15种耐药组合，耐药顺位前2位依次为Sm+Ofx(16.67%)、INH+Sm+Km(13.33%)(表3)。

三、不同性别、年龄组患者MTB临床分离株的耐药情况比较

不同性别耐药率、耐多药率、RFP耐药率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。不同年龄组的耐药率差异有统计学意义(χ2=10.933，P=0.012)，>60岁年龄组的耐药率(20.61%)明显低于其他年龄组。不同年龄组的耐多药率差异无统计学意义(χ2=7.530，P=0.057)。不同年龄组的RFP耐药率差异有统计学意义(χ2=8.145，P=0.043)，以41～60岁年龄组RFP耐药率最高(13.10%)，≤20岁年龄组耐药率最低(4.92%)(表4)。

表3 不同耐药谱在275株耐药MTB临床分离株中的分布

续表3

表4 不同性别、年龄组患者MTB临床分离株的耐药情况比较

表5 不同耐药类型在各地区MTB临床分离株耐药情况的比较

注a:3个地区比较；b:Fisher确切概率法

四、不同地区MTB临床分离株耐药情况的比较

不同地区耐药情况的两两比较结果显示：关中地区耐药率(32.02%)和陕南地区耐药率(32.11%)均明显高于陕北地区的耐药率(16.81%)，差异均有统计学意义(χ2=16.570，P=0.000；χ2=17.110，P=0.000)。关中地区单耐药率(14.89%)和陕南地区单耐药率(17.23%)明显高于陕北地区(8.41%)，差异均有统计学意义(χ2=5.356，P=0.021；χ2=9.218，P=0.002)。关中地区多耐药率(6.74%)明显高于陕北地区(2.65%)，差异有统计学意义(χ2=4.722，P=0.030)。不同地区的耐多药率、广泛耐药率、RFP耐药率差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表5)。

讨 论

在987株分枝杆菌临床分离株中，NTM的分离率为2.23%，低于2007—2008年全国结核病耐药性基线调查(3.4%)[5]和2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查(22.09%)[6]的水平。

965株MTB临床分离株的耐药率(28.50%)、单耐药率(14.30%)、多耐药率(4.56%)及对一线抗结核药物耐药率(26.01%)均低于2009—2010年陕西省平均水平(30.34%、15.96%、6.07%、29.49%)[3]，耐多药率(6.53%)、广泛耐药率(0.62%)、RFP耐药率(9.84%)及对二线抗结核药物耐药率(8.50%)与2009—2010年陕西省平均水平(5.94%、0.40%、7.78%、5.87%)相比，均有不同程度升高。与2007—2008年全国结核病耐药性基线调查数据相比[5]，我省耐药率、耐多药率均低于全国平均水平(37.79%、8.32%)，RFP耐药率略高于全国平均水平(9.63%)，主要指标耐多药率高于新疆[7]、广东[8]、浙江[9]、贵州[10]、云南[11]、山东[12]、广西[13]，低于宁夏[14]、青海[15]、甘肃[16]、安徽[17]、海南[18]、湖南[19]、辽宁[20]、四川[21]、河北[22]。以上数据表明陕西省2015年实施的结核病专病专防策略和以“在卫生行政部门领导下，建立定点医院负责患者诊疗、基层医疗卫生机构负责患者访视管理、疾控机构负责规划管理的分工明确、协调配合的防治服务体系，卫生监督部门强化传染病执法监督”为核心的新型结核病防治管理模式[2]在一定程度上遏制了耐药结核病的流行与传播。

6种抗结核药物耐药顺位依次为Sm(17.62%)>INH(15.03%)>RFP(9.84%)>Ofx(6.84%)>EMB(5.08%)>Km(2.59%)，其初、复治顺位一致，与2009—2010年陕西省和2007—2008年全国耐药基线调查报告的耐药顺位不同，表现为Ofx的耐药顺位提前于EMB，位于第4位，与近年安徽[17]、海南[18]、新疆[7]、浙江[9]报道的耐药顺位一致。本研究Ofx(6.84%)和Km(2.59%)的耐药率均高于2009—2010年陕西省(3.69%、2.18%)和2007—2008年全国(3.49%、2.34%)平均水平，可能与近年我省二线抗结核药物的不规范使用有关。

耐药谱结果显示出多态性和复杂性，共有39种耐药组合。其多态性也与全国水平相当，陕西(种)/国家(种)：单耐药6/6，多耐药(包含二线药的多耐药)20/22，耐多药13/15。耐药谱以单耐Sm、耐Sm+INH出现的频率最高，可能与Sm曾被广泛应用于抗感染治疗和Sm+INH的组合用药曾作为抗结核的主要治疗方案有关。有研究显示，在耐RFP的菌株中有95%同时也对INH耐药[3]，本研究在95株耐RFP的菌株中同时耐INH有63株(占66.32%)。早期广泛耐药(pre-extensively drug-resistant, pre-XDR)被认为是除对INH和RFP同时耐药之外，还对任何1种氟喹诺酮类药物，或对3种二线抗结核药物注射剂(卷曲霉素、Km、阿米卡星)中的至少一种耐药。在63株耐多药菌株中，pre-XDR菌株的构成比为34.92%(22/63)，其中在22株pre-XDR菌株中，主要以耐Ofx株为主，占86.36%(19/22)，与国内外报道主要以氟喹诺酮类耐药为主的结论一致[23-24]。在含二线药的多耐药谱显示，以耐Sm+Ofx比例最高(16.67%)。氟喹诺酮类药物耐药率的升高主要原因为综合医院、结核病专科医院对此类药物的滥用。氟喹诺酮类药物和二线注射类药物为WHO认定治疗MDR-TB最有效药物，氟喹诺酮类高耐药率也可能是MDR-TB治愈率低的重要原因之一。有报道，现有治疗方案对于治疗氟喹诺酮类耐药或二线注射剂耐药的早期广泛耐药患者效果并不理想[25]，面对MDR-TB的严峻疫情，要在重视现有标准化治疗方案的基础上探索更加有效的治疗方案，对MDR-TB进行更细致的分类管理及规范的治疗，以阻止MDR-TB发展为广泛耐药结核病。同时也提示开展二线抗结核药物药敏试验非常必要。

各年龄组间耐药率、RFP耐药率差异均有统计学意义，>60岁年龄组的耐药率(20.61%)明显低于其他年龄组，可能与此类人群流动性较小，就诊治疗多由亲属陪同，治疗依从性较好有关。≤20岁年龄组的耐药率为29.51%，此年龄段主要为青少年人群，提示要特别加强学校耐药结核病防治工作。41～60岁年龄组的耐药率(33.55%)、耐多药率(9.27%)、RFP耐药率(13.10%)均相对较高，提示耐药结核病多发生于中年人群，此类人群社交范围较广，活动能力较强，是社会劳动力的主要构成群体，更具有感染和传播耐药结核病的风险。因此应加强关注重点人群耐药结核病的发生情况，并采取相应控制措施，将有助于降低耐药结核病的产生与传播。

不同地区耐药率比较结果显示：关中地区、陕南地区的耐药率、单耐药率均明显高于陕北地区，可能与不同地区的地理环境、气候条件、社会经济和文化风俗不同有关，关中地区为平原地区，人口聚集，更有利于耐药结核病的传播；陕南秦巴山区由于经济条件相对落后，交通不便，医疗服务可及性差，患者治疗依从性差，从而产生耐药。不同地区抗结核药物使用频率及不同耐药菌株传播的差异也会影响各种药物的耐药率。对于地区间耐药率存在差异原因还需进一步研究。陕南地区的耐多药率(7.57%)与2005年该地区耐药监测结果(2.6%)相比[26]，有一定程度升高，提示应进一步加强该地区MDR-TB防治工作。

因本研究个别调查点获得菌株数量较少，主要原因可能为：(1)部分定点医院尚未开展培养检测，阳性样本送至省参比实验室进行培养检测时，因运送时间不及时、保存不当等原因导致培养失败；(2)部分患者选择在综合医院或医疗资源较好的省、市级结核病专科医院诊疗；(3)个别定点医院刚开展培养检测、检验人员不固定等因素，出现培养污染、涂阳培阴的情况。此外，仅对涂阳肺结核患者临床分离株进行耐药分析，而涂阴培阳、分子生物学检测阳性等其他结核病患者未纳入调查范围。以上因素可能导致与我省肺结核的实际耐药情况存在一定差距。通过本次的调查分析，初步了解了当前陕西省MTB的耐药现状和特点。自2015年推广实施新型结核病防治管理模式以来，陕西省发现并治愈了大量涂阳肺结核患者，取得一定成效，但耐药结核病流行与传播仍然不容忽视，需要各级政府的大力支持，在大卫生、大健康的理念下，开展多部门协作，建立起良好的政策、经费、机制和质量保障体系，有效控制耐药结核病的流行传播。

志谢陕西省10个市、调查县(区)的疾病预防控制中心及结核病定点医院工作人员在样本和患者信息收集、实验室涂片和培养检测及样本运输工作中给予了大力支持与协助。