鸡 饲 料 中 拉 沙 洛 西 钠 的 测 定

■金梦铭 程林丽 陈可心 丁宇丽

（中国农业大学，北京100193）

拉沙洛西钠（Lasalocid sodium）是由拉沙洛链霉菌(Streptomyces lasaliensis)产生的次级代谢产物拉沙洛西A 的钠盐。它是一种芳香聚醚类离子载体型抗生素类饲料添加剂[1]，根据我国农业部公告168 号规定，采用75～125 mg/kg拉沙洛西钠混饲的方法用于治疗鸡球虫病。但是，饲料中添加拉沙洛西钠剂量过大时会对动物产生毒性作用[2]，长期或过量使用还会产生药物残留超标等问题。目前我国采取饲料中拉沙洛西钠的测定——高效液相色谱法[3]作为检测标准之一，但是由于该标准建立的年代过久，饲料样品经提取后直接上样分析基质干扰太大，灵敏度低，无法满足现阶段对饲料样品监控的需要。因此，本研究对该饲料检测方法标准进行改进，增加了样品净化的步骤并对其它各种条件进行了优化，建立了本检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和溶液

空白鸡配合饲料、鸡浓缩饲料和鸡预混合饲料均由北京维德维康生物有限公司提供。拉沙洛西钠标准品(Lasalocid，LAS：纯度≥97%)购自Sigma公司。硅胶固相萃取柱（500 mg，6 ml），购自上海安普生物技术公司。正己烷-乙醚（50∶50，v/v）。二氯甲烷-甲醇（90∶10，v/v）、0.1%甲酸溶液、含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1，v/v）、醋酸铵溶液（125 mmol/l）。1 000 μg/ml和100 μg/ml拉沙洛西钠标准储备溶液通过用甲醇配制或稀释获得。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/ml标准工作液通过用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释标准储备液获得。

1.2 液相色谱检测方法

采用Waters 2695 高效液相色谱仪进行，配Waters 2475荧光发射检测器。色谱柱为Shim-pack VPODS C18（4.6×250 mm，4.6 μm）色谱柱。流动相为乙腈-125 mmol/l 醋酸铵溶液（85∶15，v/v），等度洗脱。流速为1.0 ml/min。进样量为20 μl。激发波长为314 nm。发射波长为418 nm。柱温为室温。

1.3 样品前处理方法

称取试样2.00 g（精确到0.02 g）于50 ml离心管中，加10 ml甲醇，涡动1 min，振荡提取40 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液。残渣中加10 ml甲醇，重复提取一次，合并两次提取液，定容至20 ml。取2 ml 提取液于40 ℃氮气吹至近干，加5 ml 正己烷通过涡动溶解残渣，为试样溶液。取硅胶固相萃取柱，用5 ml正己烷活化，在正己烷液面即将进入柱床前，加入试样溶液。用5 ml正己烷洗涤试样溶液管，并将洗涤液全部通过固相萃取柱。再用8 ml正己烷-乙醚溶液淋洗小柱，最后用6 ml二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹干，加入乙腈-0.1%甲酸溶液1 ml，涡动1 min，过滤膜后供液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与线性回归分析

各取20～1 000 μg/l 的系列浓度标准工作液相色谱分析。以药物浓度为横坐标，药物峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果如图1所示，在相应的浓度范围内，药物峰面积与浓度呈线性相关，线性回归方程为y=614.3x+14 542，相关系数大于0.998。

图1 拉沙洛西钠标准曲线

2.2 方法的检出限与定量限

取5个空白样品在不加拉沙洛西钠的基础上按样品前处理方法进行处理后上机检测，按信噪比S/N=3为检测限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ）测定方法确定检出限和定量限。结果如表1所示，饲料中拉沙洛西钠的检出限为3.57～11.83 μg/kg，定量限为11.90～39.43 μg/kg。

表1 饲料中拉沙洛西钠测定的LOD和LOQ

2.3 方法回收率及变异系数

取2.00 g（精确至0.01 g）空白鸡配合饲料、鸡浓缩饲料，以1、10、20、50、100 mg/kg；鸡预混合饲料以1、10、50、100、200 mg/kg 浓度水平进行五个浓度的添加回收试验。每个浓度设5个平行，连续做3次，计算添加回收率、日内变异系数和日间变异系数(表2)，在四个浓度添加水平下，各种饲料中拉沙洛西钠的平均回收率均满足70%～120%；日内变异系数均小于15%，日间变异系数均小于20%，表明该方法回收率高，稳定性强，准确度、精密度和重复性均符合我国对饲料检测方法的要求。三种饲料相关色谱见图2～图4，由图可知，在拉沙洛西钠保留时间位置无色谱峰干扰。

表2 饲料中拉沙洛西钠添加回收率及变异系数

2.4 色谱分析

本方法采用Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 μm）色谱柱分析，采用甲醇提取样品，样品提取液加水稀释后通过硅胶固相萃取柱净化，以乙腈-125 mmol/l醋酸铵为流动相进行等度洗脱分离。出峰时间在14.2 min左右。A为空白样品，B为0.2 μg/ml拉沙洛西钠标准溶液，C为混合拉沙洛西钠的饲料空白样品，在400 μg/kg的空白样品添加回收试验中，分别用配合饲料样品、浓缩饲料样品、预混合饲料样品制备的空白样品、添加拉沙洛西钠标准溶液样品和空白添加样品进行测试，色谱图见图2～图4。根据同种饲料和混合饲料的三种样品的色谱图，可以明显看出在药物的保留时间处无杂峰干扰，色谱峰明显。

3 讨论

图2 配合饲料样品色谱

图3 浓缩饲料样品色谱

图4 预混合饲料样品色谱

拉沙洛西钠为中等极性的疏水性物质,可采用极性溶剂、稀酸或缓冲液提取，经离心后做进一步净化。文献报道的方法多采用乙腈、酸化乙腈、甲醇和酸化甲醇进行饲料样品中拉沙洛西钠的提取，也有少数方法采用弱碱性溶液提取[4-7]。这些检测方法各有其特点，且方法论述详尽，比较成熟。因此，实验室对上述提取方法都进行了试验，最后采用甲醇作为提取溶剂。为了提高提取效率，实验室采用两次提取法，且每次提取时采用涡旋使饲料与甲醇充分接触后，接着震荡提取，使目标药物充分渗出。

从表1、表2的数据结果可以看出，本方法的回收率高、精密度好，可重复性强，同时符合经济实用的要求。从图2～图4 的空白样品和添加药品样品的色谱图可以看出，色谱保留时间处均无任何杂峰干扰，说明各种鸡饲料中的杂质对本文采取的测定方法无任何干扰。这说明本方法能够满足各种鸡饲料中拉沙洛西钠的测定。

4 结论

本研究建立了鸡饲料拉沙洛西钠测定的高效液相色谱法。在五个药物添加浓度水平下，三种饲料中拉沙洛西钠的平均回收率均满足79%～89%；日内变异系数均小于12%，日间变异系数均小于12%。本方法准确、高效、灵敏，适用于对各种鸡饲料中拉沙洛西钠的测定。