虹鳟中草药免疫增强剂体外快速筛选研究

■董春燕 姚 丽 邵 俭 安 苗 文 明 姜海波*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025）

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是我国重要的冷水性经济鱼类[1]。近年来，我国虹鳟的养殖发展迅猛，至2017 年养殖产量已达到4.146 万吨[2]。然而病害频发却成为影响产业可持续发展的重要限制因素。以往普遍采用抗生素类药物进行治疗，不仅会造成较高的药物残留，降低水产品安全性，而且还会污染水体。因此，寻找安全的抗生素替代物，用于病害防治成为当前研究热点。

中草药具有高效、低毒、低残留等优点，作为饲料在水产动物病害防治中具有广阔的应用前景[3-4]。目前有科研人员用黄芪、肉丛蓉、川芎、金银花、红花、五味子、柴胡、鱼腥草、白花蛇舌草、石斛、白术、白头翁、绞股蓝、桑螵蛸、甘草、板蓝根、天麻等25味中草药配成中药方剂，开展了提升虹鳟免疫机能的研究探索，结果显示实验组和对照组血液样品的免疫学指标差异显著，表明中药方剂具有提高免疫力的效果[5]。以茵陈、板蓝根为复方一，紫草、金银花为复方二研究发现，复方一比复方二更有效地提高虹鳟的抗氧化能力[6]。本实验以虹鳟作为研究对象，来探讨水浸提物对虹鳟外周血白细胞氧呼吸爆发活性和吞噬活性的影响。旨在初步筛选出能有效提高虹鳟免疫力和抗病能力的免疫增强剂，为虹鳟中草药免疫增强剂的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用17 种中草药购自贵阳市援生医院，中草药的中文名及拉丁文名如表1 所示。实验用鱼为贵州丽水生态农业有限公司大山三文鱼养殖场提供，共十五条，其平均体重为1.5 kg左右。

1.2 实验方法

1.2.1 中草药的初步处理及中草药浓缩提取液样品的制备

从待用中草药中各称取30 g，分别放置于干燥烘箱中，设置成恒温50 ℃烘烤24 h使其完全干燥；将各种中草药用中草药粉碎机进行粉碎后，用60目筛过筛并密封保存药粉，于室温干燥保存。17种中草药各称取2 g粉末放入100 ml烧杯中，后加入80 ml蒸馏水，煎煮至20 ml；静置冷却后去掉上清液体，再倒入蒸馏水80 ml，此方法重复三次；8 500 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm的无菌滤膜过滤，制成中草药常温浓缩提取液样品备用。

表1 中草药中文名及拉丁文名

1.2.2 虹鳟白细胞的准备

取3 尾虹鳟，用MS-222（200 mg/l）麻醉后，再用75%酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，尾静脉采血。取血用注射器为含有0.3 ml肝素钠（浓度：1 500 U 肝素钠溶于1 ml PBS 中）的10 ml 一次性注射器。将所有血液混合，加入等体积的细胞培养基（L-15 IV）。另取10 ml离心管，加入1.5 ml梯度分离液，沿管壁缓慢加入3 ml 稀释后的血液，使血液和细胞分离液有明显的分离界面。室温以2 000 r/min离心10 min；取中间层白细胞于新离心管内，加1 ml L-15 IV 轻轻混合均匀；取20 μl 细胞，加入等体积的0.2%盼蓝，显微镜下数数得到细胞悬液初始浓度；用L-15 IV将其稀释成2×107cell/ml 作氧负离子检测；5×106cell/ml作吞噬活性检测。

1.2.3 中草药对外周血白细胞吞噬活性的影响

检测中草药对外周血白细胞吞噬活性的影响。将实验分为中草药添加组和对照组，取1.5 ml无菌离心管，加入100 μl白细胞悬液（5×106cell/ml），在中草药组添加中草药提取液样品100 μl，对照组加PBS 100 μl，室温孵育1 h；每管加入100 μl 的乳胶微球，轻轻混匀，室温孵育1 h，吸去载玻片中的液体，加戊二醛100 μl，室温固定5 min，吸去液体，加入Giemsa染色0.5 h，蒸馏水冲洗，自然晾干。在油镜下分别取5个视野观察计数，每种中草药平行检测3次，计算吞噬活性率（PA）和吞噬指数（PI）。

根据PA 和PI 测定结果，筛选能同时提高虹鳟吞噬活性的中草药。

1.2.4 白细胞氧呼吸爆发活性的测定

取96 孔板，每一行为一组，每组又分A、B 2 个亚组，每个亚组3个孔，96孔板的第一行为对照组，其余各行为中草药提取液样品组。每孔加入5×106cell/ml白细胞悬液100 μl；中草药样品组的各孔再加入制备的中草药提取液100 μl，对照组的各加入PBS 100 μl。室温孵育2 h后，每孔吸去上清200 μl，用100 μl细胞培养液L-15 洗涤3 次；A 亚组各孔添加50 μl 细胞培养基L-15，B 亚组各孔添加细胞培养液L-15 和NBT各50 μl，再用PBS 将所有各孔补齐到200 μl。室温孵育1 h 后，每孔吸去100 μl 上清，加100 ml 甲醇固定3 min，再吸去100 μl上清，用100 μl甲醇（70%）洗涤3 次。轻轻吸去各孔内的所有液体，室温风干后，每孔加入2 mol/l KOH 100 μl 和DMSO 200 μl；用酶标仪测定各孔OD 630 nm 值，分别计算B 组氧呼吸爆发活性（SPO），B 组氧呼吸爆发活性提高率活性[NBTB（%）]。

2 结果

2.1 白细胞吞噬活性测定结果（见表2）

表2 不同中草药对虹鳟外周血白细胞吞噬活性和吞噬指数的影响

由表2 可知，对照组吞噬活性（PA 值）达到（0.28±0.024）、吞噬指数（PI 值）为（1.31±0.04）。天麻组的吞噬指数（PI 值）低于对照组，表明天麻会抑制虹鳟外周血白细胞的吞噬活性；白芨、厚朴、麻黄、丹参、大黄、马齿苋、泽泻、黄柏、苍耳子、贯众、红景天11 种中草药添加组的吞噬活性（PA 值）显著高于对照组（P＜0.05），蒲公英组的吞噬指数（PI 值）显著高于对照组（P＜0.05）。

2.2 氧呼吸爆发活性测定结果

对17种中草药添加组进行白细胞氧呼吸爆发活性测定，实验结果见表3：白头翁、桂桔、白芨、大黄、贯众、红景天中草药添加组的SPO 值显著高于对照组；16种中草药的NBTB（%）都大于15%。

表3 不同中草药对虹鳟血白细胞呼吸爆发活性的影响

3 讨论

本实验发现大黄、白芨、红景天和贯众这4 种中草药既可同时提高虹鳟外周血白细胞的氧呼吸爆发活性和吞噬活性。大黄在水产动物方面研究较多，有研究发现在草鱼（Ctenopharyngodonidellus）饲料中添加大黄能显著或极显著增强草鱼血细胞吞噬率和吞噬指数[5]；陈孝煊研究报道大黄可明显提高异育银鲫（Allogynogeneticcrucian carp）血液白细胞吞噬能力[7]；而吞噬活性作为鱼类的一种免疫参数，白细胞吞噬能力的高低能直接反映出鱼类非特异性免疫能力的大小，大黄提取物主要成分大黄素等能促进建鲤（Cyprinuscarpiovar. Jian）的生长，增强鱼体的免疫力[8]。红景天对小鼠外周血白细胞的吞噬能力有显著提升作用[9]；红景天能够通过增加尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）血液中红细胞体积、胞内血红蛋白含量以及血细胞比容来改善其血液免疫系统，以此来提高其氧呼吸爆发活性[10]。王庆奎研究表明贯众可提高斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬率和吞噬指数，从而提高斑点叉尾鮰（IetalurusPunetaus）血液白细胞吞噬能力[11]；贯众实验组中哲罗鲑（Huchotaimen）各组织超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性有明显的升高，其中以血细胞SOD活性提升最为显著[12]；SOD是自由基损害的主要防御酶，可催化超氧阴离子自由基的歧化反应，从而阻断自由基的连锁反应，提高氧呼吸爆发活性。根据对虹鳟的氧呼吸爆发活性和吞噬活性的测定表明，在饲料中添加一定量的大黄、白芨、贯众和红景天可以提高虹鳟的非特异性免疫机能，但作用机理还有待更深入研究。

4 结论

在本试验条件下，筛选出白芨、大黄、贯众、红景天4 种中草药能够显著提高虹鳟外周血白细胞的氧呼吸爆发活性和吞噬活性，为虹鳟中草药免疫增强剂组合方剂的设计提供了理论依据。