饲料蛋白酶的最新研究与应用进展

■于书坤

(杜邦营养与生物科学研发中心，丹麦奥胡斯DK-8220)

蛋白质、碳水化合物和脂肪是三种主要的常量营养元素，可提供动物生长所需的能量和必需营养物质。以蛋白质为例，必需的营养元素是氨基酸，它也是机体和所有生物代谢过程中必需的。动物可产生内源蛋白酶来消化蛋白质，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是最主要的内源蛋白酶。一般来说，内源蛋白酶对饲料蛋白的消化效率为80%～90%，因此，添加外源蛋白酶可起到辅助补充作用，进一步提高蛋白质的消化率。在猪禽营养中，高效的蛋白质消化率可以更有效、更充分的实现饲料原料的应用价值，保证生产效率，维持肠道健康和减少环境中氨氮的排放。除了对蛋白质营养的贡献外，蛋白酶也可以协助释放其它养分（如淀粉、脂肪和矿物质）、降解蛋白类抗营养因子和抗原（如植物凝集素、伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子）。抑制上述抗原类所诱导的不必要的耗能免疫反应，降低未被动物消化的养分水平。并且，通过增加蛋白质的消化率，蛋白酶还可以降低到达胃肠道（GIT）后段的蛋白质含量，从而减少有害微生物的发酵底物。

1 偏碱性蛋白酶更广泛的底物特异性与动物内源蛋白酶具有互补作用

蛋白质是氨基酸多聚体，由20 种不同的天然氨基酸组成。对于活的生物体来说，氨基酸是最重要的生命建筑基石。氨基酸之间通过肽键连接起来形成聚体称作肽。根据肽其长短可以分为短链肽（寡肽，由2～3 个氨基酸组成的二肽和三肽）、中链（多肽）和长链肽（即蛋白）。蛋白酶的作用即通过水解连接氨基酸的肽键，降解蛋白质至多肽和寡肽甚至游离的氨基酸。动物摄入的饲料蛋白质首先在胃肠道被水解成中链多肽，然后进一步水解成寡肽、三肽、二肽或者游离氨基酸。游离氨基酸、二肽和三肽均可以直接被小肠吸收，其途径是通过小肠上皮细胞膜上的转运子，最终进入血液循环。

胃肠道（也称消化道）中第一个对饲料蛋白质进行水解的蛋白酶即是胃蛋白酶。胃蛋白酶是由胃（猪）或者腺胃（禽）中分泌的。它属于酸性蛋白酶，分泌后在pH 值5.0 以下激活并表现活力，在低pH 值环境中活性最高。胃蛋白酶具有广泛的底物特异性，但是，研究表明，与偏碱性蛋白酶相比，它对于三个碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）旁的肽键水解效率不高（表1）。另外，尽管胃蛋白酶具有广泛的底物特异性，但是，由于饲料蛋白质在胃中的有限停留时间，以及在低pH值下并不是所有蛋白质都能有效地发生水合作用和被溶解，因此，在这里饲料蛋白质并不能很好的被水解。

在小肠中，pH 值由酸性转化为更接近中性和碱性水平，且有胆汁酸表面活性剂的协助，使得一些饲料蛋白质的溶解性发生改变，但是，同时也降低了胃蛋白酶的效率。因此，这就需要动物体分泌一组新的蛋白消化酶。通过胰腺分泌至肠道的胰液中包含胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶，它们的最适pH值与小肠的酸碱度吻合。与胃蛋白酶不同，胰腺分泌的这些蛋白酶底物特异性比较狭窄，众所周知，胰蛋白酶只水解碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸旁的肽键（表1）；糜蛋白酶比较偏重于水解大分子的疏水性氨基酸旁的肽键，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及亮氨酸；胰弹性蛋白酶则更喜欢水解含有小的疏水侧链的氨基酸旁的肽键，如丙氨酸、缬氨酸及亮氨酸。尽管从整体考量这三种蛋白酶一起作用，底物特异性范围也较广，但是，值得注意的是，胰蛋白酶是胰腺分泌的主要的蛋白酶，糜蛋白酶的分泌量大约只有它的50%，弹性蛋白酶的量更少。换言之，胰腺分泌的蛋白酶更倾向于水解赖氨酸和精氨酸旁的肽键，而不是水解蛋白中所有的肽键。

表1 动物内源消化酶和偏碱性蛋白酶水解蛋白质肽键的偏好性(%)

偏碱性蛋白酶是一种具有广泛底物特异性，细菌来源的单一组分内切饲料蛋白酶。它在小肠的pH值条件下可以高效工作，在中性和碱性pH 值范围内活性最高，在胃肠道前段pH 值3～4.5 条件下，它仍然具有较高的酶活水平。例如，基于液谱质谱（LC-MS）仪检测的所产生的多肽和寡肽的总数量，偏碱性蛋白酶在pH值3.7时与猪胃蛋白酶纯酶等重量的基础上，仍然具有大约猪胃蛋白酶纯酶40%的活性。其广泛的底物特异性表明，它与胃蛋白酶和其它三种胰腺分泌的蛋白酶具有肽键水解功能互补性（表1）。这是由于该偏碱性蛋白酶不仅可以水解胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶所能水解的肽键，而且它还可以水解以上四种蛋白酶比较不易水解的肽键（表1）。

植物来源的蛋白质往往富含酸性氨基酸，即天冬氨酸和谷氨酸以及它们的酰胺衍生物，如天冬酰胺和谷氨酰胺（表2）。但是，胰腺分泌的蛋白酶不易水解由这些氨基酸组成的肽键，而偏碱性蛋白酶可以对其进行有效水解（表1）。除了对天冬氨酸和谷氨酸表现高酶活外（表2），比较于猪胰蛋白酶，在底物为还原牛血清白蛋白（BSA）和大豆分离的全蛋白，pH 值6.5 条件下，LC-MS 检测结果表明偏碱性蛋白酶对苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸这6 种氨基酸旁的肽键都具有比较高的活性（见表1）。本文所用猪胰蛋白酶（Sigma P7545）是一组胰腺分泌的中碱性消化酶混合物，包含内切的胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和外切的蛋白酶（羧肽酶A，B）及胰淀粉酶、胰脂肪酶等。

表2 动物饲料中主要蛋白原料（豆粕和菜籽粕）和谷物（玉米和小麦）的氨基酸组成（%）

表2 （续） 动物饲料中主要蛋白原料（豆粕和菜籽粕）和谷物（玉米和小麦）的氨基酸组成（%）

2 偏碱性蛋白酶产物为可消化小肽

偏碱性蛋白酶除了上述提到的具有广泛的底物特异性之外，体外实验结果还表明，它可以更早地水解饲料原料中的蛋白质，即在胃和肠道前段（如家禽的嗉囊、腺胃和肌胃以及猪的胃中）释放小肽和被包被的养分。在胃和上消化道（十二指肠）低pH值（例如pH值3.7）条件下，偏碱性蛋白酶与猪胃蛋白酶在等重量基础上，水解底物产生分子量小于3 500道尔顿的小肽的量接近（图1A）。假如在胃和肠道前段即可更早地发挥蛋白质水解活性，则可以通过水解反应快速处理掉蛋白类抗营养因子，降低对蛋白质消化的负影响，从而优化了水解蛋白质底物的时间。我们最新的数据显示，在小肠pH值6.5的条件下，基于LC-MS 检测的所产生的多肽和寡肽的总数量，在等重量基础上比较，以水解产生的寡肽、多肽的总量为标准，偏碱性蛋白酶具有猪胰蛋白酶2.8倍的活性，可以水解产生1.7倍于猪胰蛋白酶分子量小于1 100～1 200道尔顿的“可消化小肽”（图1B）。可消化小肽是指是由10个或少于10个氨基酸残基组成的，分子量小于1 200道尔顿的寡肽。它们更易扩散入肠道表面的黏膜层，进而被小肠刷状缘结合的寡肽酶降解成可直接吸收的二肽和三肽。

3 偏碱性蛋白酶独特作用方式

不同于其它蛋白酶，偏碱性蛋白酶的作用方式很独特；它不会与胃蛋白酶、胰蛋白酶和其它胰腺分泌的动物内源蛋白酶在蛋白水解方面产生竞争，而是与这些内源蛋白酶产生互补作用。

由于偏碱性蛋白酶具有不同的底物特异性（见表1），与胃蛋白酶和胰腺分泌蛋白酶相比，基于水解多肽位点的差异可产生一组不同的小肽。

基于纯的酶蛋白特性，尽管偏碱性蛋白酶最优作用范围在偏碱性pH值范围，以水解产生的寡肽、多肽的总量为标准，它在胃环境中仍具有约猪胃蛋白酶40%的活性，可产生类似数量的可消化小肽（图1A）。

我们最新的数据显示，偏碱性蛋白酶和猪胰腺分泌的蛋白酶在小肠环境中所产生的可消化小肽的量，前者超过后者70%(图1B)。

偏碱性蛋白酶不受植物源蛋白类酶抑制因子的影响，而胰蛋白酶和糜蛋白酶均会受抑制因子影响，这是因为它们可以和这些抑制剂形成难解离的复合物，如，大豆胰蛋白酶抑制因子(STI)和大豆胰蛋白酶-糜蛋白酶抑制因子(STCI)(图2)。植物源蛋白类酶抑制因子不仅富集于大豆中，也同样存在于其它植物性饲料原料中。

图1 液相色谱/质谱（LC/MS）联用分析

图2 饲料中内源抑制剂对胰蛋白酶和偏碱性蛋白酶活力的影响

在一定程度上，偏碱性蛋白酶可以降解这些植物源蛋白类抑制因子、植物凝聚素等抗营养因子，从而降低这些抗营养因子对饲料蛋白消化吸收的负面作用。

4 偏碱性蛋白酶不仅表现在提高蛋白质的消化率

众所周知，植酸酶具有“超越释放植酸磷”的作用，饲用蛋白酶也证明具有“超越降解蛋白”的效果。除了提高蛋白质氨基酸的消化率外，偏碱性蛋白酶也可提高饲料中淀粉、脂肪和包括纤维等结构性碳水化合物的消化率。这是因为在饲料中不同的养分之间存在着紧密的结构联系。例如谷物中的淀粉颗粒常常被贮存蛋白包被，油脂（甘油三酯）以脂肪体的形式贮存，外周是以蛋白质和磷脂组成的膜包裹（图3）。

以玉米为例，淀粉分布在胚乳的两个区域，角质区域和粉质区域（图3A）。较粉质区域，角质区域的淀粉颗粒更紧实的结合在淀粉-蛋白基质上（图3B，3C）。很明显，包被玉米淀粉粒的蛋白质（玉米醇溶蛋白、白蛋白、球蛋白、谷蛋白）须先降解，淀粉酶才能进而水解淀粉。植物细胞中包被脂肪体的结构蛋白叫做油脂蛋白（图3D）。

5 偏碱性蛋白酶与内源蛋白酶以及其它饲料酶均具有互补协同作用

本质上所有的饲料酶都是蛋白质，因此，检测外源蛋白酶对饲料酶（如植酸酶、木聚糖酶和淀粉酶）的影响是非常重要的。在体外高浓度条件下，我们实验室对这些饲料酶之间的相互作用进行了广泛的测试，结果表明偏碱性蛋白酶对所测饲料酶，如木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶以及动物内源胃蛋白酶和胰蛋白酶都没有负作用。尽管如此也需注意，即高浓度的液体蛋白酶产品在与饲料混合之前不应该与其它饲料酶预混。

图3 蛋白、淀粉和脂肪之间的结构特点

偏碱性蛋白酶添加到饲料中，可与动物体内源胃蛋白酶和胰蛋白酶产生协同作用。我们的研究表明偏碱性蛋白酶也可与木聚糖酶产生协同作用提高蛋白的释放量，这主要是由于谷物中某些蛋白和结构碳水化合物的紧密联系。

6 偏碱性蛋白酶在家禽和猪上的生物学效率

任何饲料酶产品的效果都是通过动物的生长性能来表现的。偏碱性蛋白酶在肉鸡和猪的日粮中都进行了测试，结果表明均可显著改善动物的生长性能（图4）。在1～42 d肉鸡试验中，负对照（NC）饲喂氨基酸和能量缺乏的玉米豆粕型日粮，在此基础上添加偏碱性蛋白酶可以显著降低料肉比（FCR）4.1%，显著提高体增重（BWG）60～70 g/只。在25～65 kg 生长猪的试验中，饲喂添加副产品的玉米豆粕型日粮，添加偏碱性蛋白酶显著降低FCR 6.9%，BWG无显著差异，表明偏碱性蛋白酶提高了饲料利用效率。

图4 偏碱性蛋白酶对肉鸡和生长猪生长性能的影响

7 展望

随着世界人口的不断增加，消费者对动物蛋白质的需求也在不断增加，生产商将会更加关注生产效率。由于饲料原料质量和价格的差异性和浮动性，成本效益将永远是重中之重。就动物蛋白生产的长期可持续性而言，环境管理也是重要的影响因素。在这些前提下，饲料蛋白酶将发挥非常重要的作用：提高饲料原料的价值；提高饲料原料中氮的存留；改善动物生产对环境可持续发展的负影响，最终提高生产效率和生产商的利润。偏碱性蛋白酶作为饲料蛋白酶的一种，它的功能与内源蛋白酶，无论是酸性胃环境中的胃蛋白酶，还是中性碱性肠道环境中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶，都具有很好的互补性，可以更好的协同发挥蛋白酶的作用。