原生质体紫外诱变法选育高产γ-氨基丁酸秀珍菇菌株

张亚青，张 羡，付佳伟，楼 坚,2,3，刘士旺,2,3

(1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州 310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，杭州 310023)

秀珍菇又名环柄侧耳、环柄斗菇、姬平菇和小平菇等，隶属担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌目(Agaricals)、侧耳科(Pleurotaceae)、侧耳属(Pleurotus)[1-2]。秀珍菇不仅营养丰富，而且味道鲜美，蛋白质含量比双孢蘑菇、香菇、草菇更高，质地细嫩，纤维含量少，口感脆嫩。有资料表明，秀珍菇中含蛋白质3.65%～3.88%、粗脂肪1.13%～1.18%、还原糖0.87%～1.80%、糖分23.94%～34.87%、木质素2.64%、纤维素12.85%、果胶0.14%等。它的蛋白质含量高于香菇、蘑菇，接近于肉类，比一般蔬菜高3～6倍，含有17种以上氨基酸[3]。它富含人体自身不能合成，日常饮食中通常又缺乏的苏氨酸、赖氨酸、亮氨酸等多种必需氨基酸，长期食用可提高人体免疫功能[4-6]。因此，秀珍菇是一种高蛋白、低脂肪的营养食品[7]，具有独特的风味和生理功能，符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对新食品资源开发“天然、营养、保健”的要求，具有广阔市场前景，也成为目前食用菌商业生产中研究的热点领域。

在秀珍菇培养基原料选择、生产栽培条件控制、栽培模式等研究基础上，人们对秀珍菇高品质菌株研究提出了更高的要求[8-9]，高品质高产量秀珍菇选育是众多秀珍菇研究者特别感兴趣的课题之一，但优质秀珍菇菌株选育方面的研究较少。因此，本文开展了秀珍菇原生质体的制备条件和诱变研究，以期为筛选高质量高含量γ-氨基丁酸(GABA)秀珍菇菌株及其利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种与试剂

秀珍菇菌种X1：浙江绿满都菌业自有生产种；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose ager,PDA)购自杭州百思生物技术有限公司；蔗糖购自永华化学科技(江苏)有限公司；麦芽浸取物(Malt extract)购自北京双旋微生物培养基制品厂；纤维素酶(R10)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；溶壁酶(LWZ)购自广东碧德生物科技有限公司；葡萄糖购自江苏强盛功能化学股份有限公司；γ-氨基丁酸(GABA)购自阿拉丁试剂有限公司；2,4-二硝基氟苯(FDNB)购自西亚化工有限公司；乙酸、乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、山梨醇、甘露醇均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9246A)，上海精宏实验设备有限公司；电子天平(TP-114)，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；恒温水浴锅(HH-4)，江苏金坛市仪器厂；pH计(PB-10)，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；色谱柱sunfireTMC18 5.0 μm 4.6 mm×250 mm column购自美国沃特世科技(上海)有限公司；高效液相色谱仪(UV/Visible detector)，美国沃特世科技(上海)有限公司；高压灭菌锅(YXQ-LS-30SII)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；无菌操作台(SW-CJ-2FD)，苏州净化设备有限公司；恒温生化培养箱(HWS-250)，宁波海曙赛福实验仪器厂；光照培养箱(BSG-250)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；离心机(Allegra X-30R Centrifuge)，美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.1.3 培养基及所用溶液配方

PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂粉末43 g，双蒸水1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

PDA液体培养基：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B10.01 g，双蒸水1 000 mL，pH值7.2～7.4，121 ℃高压灭菌15 min。

YMG固体培养基：麦芽浸取物10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，琼脂18 g，双蒸水1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

YMG液体培养基：麦芽浸取物10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，双蒸水1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

贮液A：酒石酸铵10 g，磷酸二氢钾20 g，硫酸钠5.8 g，磷酸氢二钠(无水)45 g，双蒸水定容至500 mL，加入几滴氯仿室温保存。

贮液B：硫胺素0.02 g，双蒸水定容至500 mL，过滤除菌后4 ℃保存。

贮液C：氯化镁12.5 g，双蒸水定容至500 mL，121 ℃高压灭菌15 min，室温保存。

完全培养基(CM)：葡萄糖10 g，天冬酰胺2 g，腺嘌呤硫酸盐0.1 g，酵母提取物0.75 g，麦芽提取物1.13 g，酪蛋白胨0.75 g，贮液A 25 mL，贮液B 1 mL，贮液C 10 mL。固体培养基需要另加入15 g琼脂粉，121 ℃高压灭菌15 min。

固体再生培养基：麦芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，琼脂18 g，0.5～1.2 mol/L稳渗剂，双蒸水定容到1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

稳渗剂为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mol/L的蔗糖、山梨醇、氯化钠、甘露醇，过滤除菌。

0.2 mol/L马来酸缓冲液：马来酸4.64 g，双蒸水定容至200 mL；马来酸钠6.4g，双蒸水定容至200 mL；将上述酸碱溶液以体积比1∶2.5混合，调节pH值至5.5，121 ℃高压灭菌15 min。

MM缓冲液：1.0 mol/L甘露醇25 mL，0.2 mol/L马来酸盐缓冲液(pH值5.5)12.5 mL，双蒸水12.5 mL，过滤除菌。

MMC缓冲液：1.0 mol/L甘露醇25 mL，0.2 mol/L马来酸盐缓冲液(pH值5.5)12.5 mL，双蒸水12.25 mL，氯化钙(1 mol/L)0.25 mL，过滤除菌。

溶壁酶或(纤维素酶)溶液： 分别称取0.02、0.03、0.04 g溶壁酶或(纤维素酶)粉末溶于2 mL常温MM缓冲液中，获得10、15、20 g/L的酶液，用无菌的0.4 μm的微孔滤膜过滤除菌后放于4 ℃冰箱中保存备用(当天配制当天使用)。

1% FDEB溶液：量取2 mL 2,4-二硝基氟苯置于200 mL乙腈中，保存于棕色试剂瓶中。

出菇物料：麸皮170 g，木屑280 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，氧化钙2 g，双蒸水600 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及菌丝体的培养

将4 ℃保藏的X1菌种转接到PDA固体培养基上，于25 ℃恒温培养箱下静置培养5 d，待菌落直径长至9 cm，占培养皿一半左右，且气生菌丝旺盛时，即获得活化秀珍菇菌种。切取绿豆大菌块，转接到PDA液体培养基后，于25 ℃恒温培养箱下静置培养7 d左右，即可获得原生质体制备所需菌丝体[10]。

1.2.2 原生质体的制备

根据秀珍菇菌种的生长状况，选取长势最好的三角瓶中菌丝体，进行下一步原生质体的试验[11-13]，离心收集培养好的菌丝体，用渗透压稳定剂MM缓冲液冲洗3次，并移去多余水分。按照每10 mg湿菌丝体加0.4 mL酶液的比例添加酶液到菌丝体管中，轻轻摇匀，在25 ℃和30 ℃下进行酶解。每间隔15 min轻轻颠倒数下使样品混合均匀，酶解4 h后吸取少量的酶解液进行镜检，观察菌丝体的变化并计数原生质体密度。在观察4 h之后对比溶壁酶和纤维素酶的酶解效果，统计并得出最佳酶解温度以及最佳酶含量。过滤收集酶解液，并于室温下750 g离心力下离心10 min，收集原生质体。分别以MM缓冲液和MMC缓冲液洗涤原生质体各2次，最后重悬原生质体备用。

1.2.3 原生质体的再生

用渗透压稳定剂稀释原生质体悬液，将密度调至1×105个/mL。以每个皿0.1 mL的量，涂布于固体再生培养基平皿中，于25 ℃恒温培养箱下培养7 d，统计菌落再生率。固体再生培养基稳渗剂种类分别为蔗糖、山梨醇、氯化钠、甘露醇，稳渗剂摩尔浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mol/L。对照处理原生质体悬液用无菌水稀释，并按上述同样方法涂布于低渗培养基上(固体YMG培养基)，观察试验组平板和对照组平板的菌落数。原生质体再生率公式如下：

1.2.4 原生质体紫外诱变

将1.2.2制备的原生质体涂布于稳渗培养基上，所选择的稳渗培养基通过1.2.3的试验结果来进行筛选。打开培养皿盖，为防止染菌，紫外光照由超净台提供[14-15]。将培养基放入35 W紫外灯下分别照射15、30、45、60、120 s。光照完毕后立即放入避光霉菌培养箱中，于25 ℃下培养7～10 d直至获得再生菌落，并统计致死率[16-17]。

1.2.5 候选突变株长势对比

经过紫外诱变后，选取致死率高的处理条件，随机挑取3株再生菌落分别命名为X2、X5、X57，将出发菌株以及挑选出的菌株转接至YMG固体培养基和CM固体培养基中，培养并观察长势。将3株候选突变株及出发菌株接种至出菇物料瓶中，待菌丝体布满整个瓶子时，将其放入光照培养箱，待其出菇后摘取烘干并磨成粉末备用。

1.2.6 候选突变株GABA含量分析

将3株候选突变株及出发菌株接种于YMG液体培养基中，18 ℃恒温培养箱培养。测定液体培养的4株菌株菌丝体的GABA含量。选取在YMG固体培养基上长势最好的突变株接种于YMG液体培养基中，并将其分成4个处理组，其中2组加4 mL的质量分数为1%的谷氨酸溶液，分别记为A1、A2，另2组不作处理，分别记为B1、B2。将A1、B1放在18 ℃恒温培养箱中培养，将A2、B2放在28 ℃恒温培养箱中培养，培养一段时间之后，测菌丝体的GABA含量。标准曲线的制作，取GABA标准样品6个，质量浓度分别为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 g/L。准备纤维素酶液，调节pH值到4.0，酶液缓冲液由乙酸钠和乙酸组成。将试样中的悬浮物置于80 ℃烘箱下烘2 h左右，烘干后的悬浮物用研钵磨成粉末，称重，将其放入试管中，每根试管加入10 mL的酶液，45 ℃水浴1 h，沸水浴15 min，冷却一段时间后进行离心，取上清液5 mL左右。取上清液以及准备好的标准样品各0.2 mL，分别加入0.2 mL的0.5 mol/L碳酸氢钠和0.2 mL的1% FDEB溶液，在60 ℃的烘箱下放置1 h进行衍生化反应，然后加1.4 mL体积分数为0.12%的磷酸溶液避光处理，且每组做3个平行，其他发酵液衍生化的处理步骤与此相同[18]。对烘干后的子实体粉末同样按照上述方法处理，并测GABA含量，测量方法参考文献[19]。高压液相的运行参数，柱子型号为SunfireTMC18，流动相：乙腈/H3PO4水溶液(体积分数为0.12%)为50/50，检测波长为370 nm，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 秀珍菇原生质体制备结果

按每10 mg加0.4 mL酶液，分别于25 ℃和30 ℃下进行酶解4 h，取酶液统计原生质体密度，结果见表1。从表1可以看出20 mg/mL溶壁酶(LWZ)所释放出的原生质体数目最多，其酶解效果较好，同时30 ℃下原生质体得率略高于25 ℃。因此，后续试验中采用LWZ(20 mg/mL)30 ℃下进行再生试验所需原生质体制备。

表1 不同水解酶种类和含量下秀珍菇X1原生质体密度Table 1 Concentration of protoplast of Pleurotus geesteranus X1 under different hydrolase types and contents

2.2 原生质体再生结果

表2秀珍菇原生质体在蔗糖稳渗培养基上的再生率统计

Table2Statistics of regeneration rate of protoplasts fromPleurotusgeesteranuson sucrose steady infiltration medium

蔗糖摩尔浓度/(mol·L-1)再生率/%0.50.24±0.030.60.32±0.090.70.28±0.140.80.15±0.070.90.10±0.051.001.101.20

以蔗糖为试验稳渗剂，添加到YMG培养基中，涂布原生质体后统计原生质体再生率，结果见表2。从表2可以看出，蔗糖摩尔浓度为0.6 mol/L时原生质体的再生率最高。后续甘露醇、山梨醇和氯化钠适宜稳渗浓度筛选设定为0.5～0.8 mol/L。

以甘露醇、氯化钠、山梨醇为试验稳渗剂，添加到YMG培养基中，涂布原生质体后统计原生质体再生率，结果见表3。从表3中可以看出甘露醇的最优浓度为0.6 mol/L，再生率为0.65%左右,氯化钠的最优浓度为0.5 mol/L，再生率约为0.09%，山梨醇的最优浓度为0.6 mol/L，再生率为0.35%左右。故选择甘露醇0.6 mol/L作为紫外光照的稳渗培养基。

表3 秀珍菇原生质体在3组稳渗培养基上的再生率Table 3 Regeneration rate (%) of protoplasts of Pleurotus geesteranus on three groups of stable osmotic media

2.3 原生质体紫外诱变结果

经过梯度时长紫外光照培养皿后，再生菌落形貌见图1，致死率统计结果见表4。从图1可以看出，获得分离度良好的秀珍菇原生质体再生单菌落，再生菌落的长势较好，菌丝白且致密。从表4可以看出，当照射时长达到1～2 min时，致死率达到76%～86%，属一般认可的正向突变率较高的致死区间。随机挑取3株紫外光照2 min的再生菌落(X2、X5和X57)进行后续性能测试，包括高效液相色谱法测定GABA含量。

图1 经紫外照射后再生菌落的形态Fig.1 Morphology of regenerated colonies after ultraviolet irradiation

表4不同紫外光照下秀珍菇原生质体致死率统计

Table4Mortality statistics of protoplasts ofPleurotus

geesteranusunder different ultraviolet irradiations

照射时间/s致死率/%1526.43047.84561.36076.912085.6

2.4 候选秀珍菇突变株长势对比

秀珍菇菌株X1为出发菌株，X2、X5和X57为从紫外光照2 min的平板中随机挑取的3株候选突变株，3株候选突变株以及出发菌株在不同培养基上的长势情况见图2。从图2可以看出，在YMG培养基上，突变株X5长势弱于出发菌株，X57长势强于出发菌株，X2长势与出发菌株基本上持平；在CM培养基上，X5长势强于出发菌株，X57长势与出发菌株基本上持平，X2长势强于出发菌株。

图2 候选突变株在YMG和CM培养基上的长势对比Fig.2 Comparison of growth potential of candidate mutants on YMG and CM media

图3 候选突变株子实体Fig.3 Fruiting bodies of candidate mutants

候选突变株接种至出菇物料后生长出的子实体见图3。从图3可以看出，其子实体颜色偏白，有微小的伞柄，由于是突变株并且在瓶中培养，存在水分、空气、光照等因素的影响，形状与市场上的有一定差异。

2.5 候选突变株GABA含量对比

X1(18 ℃)菌丝粉提取物、X1子实体提取物及0.9 g/L标准液的出峰图见图4。由图4(c)可知，标样中GABA保留时间约为5.8 min，从图4(a)可以看出，在5.8 min左右的时间X1菌丝粉提取物中有一个比较小的峰，从图4(b)可以看出，X1子实体提取物也有一个较小的波峰，0.9 g/L的GABA标准液则是在5.8 min左右有一个很明显的峰，其他标准液也是如此，由此可以确定GABA的出峰时间是在5.8 min。

由标准液求出其标准曲线图5。取0.2 mL所测液稀释至2 mL，用图5所得峰面积-浓度方程计算出的含量，乘以10倍即为GABA的真实含量。查阅得知GBAB分子量为103，已知0.2 mL内GABA含量，计算公式为

其中，x为菌菇粉GABA含量，μg/g；m为0.2 mL所测液中GABA质量浓度，g/L；n为菌菇粉质量，g。

图4 GABA测定高效液相色谱峰图Fig.4 The peak diagram of high performance liquid chromatography determined by GABA

图5 GBAB标准曲线Fig.5 GBAB standard curve

试验的4株菌株菌丝体的GABA含量见表5，从表5可以看出突变株X2、X5和X57的菌丝体GABA含量均高于出发菌株X1，提高幅度分别为20.7%、196.3%和126.8%。在向培养基中添加GABA前体(谷氨酸)时，GABA产量获得进一步提高。X57(18 ℃+质量分数为1%的谷氨酸溶液)与X57(18 ℃)相比，提高幅度为312.37%。在28 ℃下GABA产量提高幅度则要比18 ℃下低得多，这表明温度条件对GABA累积有一定的影响。

表5 菌丝中GBAB含量检测表Table 5 Detection table of GBAB content in mycelia

X2、X5、X57等3株突变株子实体中GABA含量分别达到(6.32±1.05)、(17.60±2.28)和(10.28±2.16)μg/g。较出发菌株5.21±0.47 μg/g，3株突变体子实体中GABA含量分别提高了21.3%、237.8%和97.3%。

3 结 论

通过此次原生质体紫外诱变育种方法进行高产γ-氨基丁酸的秀珍菇菌株选育工作的试验，可以得出以下结论：

1)MM缓冲液中，20 mg/mL的溶壁酶能够有效去除秀珍菇细胞壁，获得密度达到2×106个/mL的原生质体。

2)秀珍菇X1菌株原生质体再生适宜培养基为含有0.5 mol/L甘露醇的YMG培养基，原生质体再生率可达到0.65%±0.13%。

3)秀珍菇X1原生质体紫外诱变适宜照射时间为1～2 min，致死率为76%～86%之间。

4)初步获得3株突变株，菌丝体和子实体中，3株突变株GABA含量较出发菌株分别提高了20.7%、196.3%、126.8%和21.3%、237.8%、97.3%。