植物合成生物学课程实验教学初探

潘炜松 汪启明 谭成方 刘齐军

摘 要 植物合成生物学是生命科学相关专业重要的前沿专业课程，课程实验对于学生深刻把握合成生物学的学科理念和实验技术具有重要的意义。结合教学实践，本文介绍了我校植物合成生物学课程实验的设计思路和实践经验。

关键词 植物合成生物学 创新人才 人才培养

中图分类号：G424                                     文献标识码：A    DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2019.04.048

Abstract Plant synthetic biology is an important specialized course of life science. The experiment teaching of plant synthetic biology is of great significance for students to grasp the concept and experimental technology of synthetic biology. Combining with teaching practice in our university， this paper introduces the design idea and practical experience of the experiment of plant synthetic biology.

Keywords plant synthetic biology; innovating talent; cultivation

2010年5月21日，美国生物学家及企业家J. Craig Venter领导的合成生物学研究团队在Science发表了具有划时代意义的研究成果——首个人造生命（命名为“辛西娅，Synthia 1.0”）。其通过完全化学方法合成的基因组包含约901个基因序列，长达100万碱基对。[1]在初代辛西娅的基础上，6年后该团队继续在Science杂志报告称，他们设计并合成出一种具有最小基因组的微生物（“Synthia 3.0”），辛西娅3.0具有473个基因，在实验室条件下可以自我复制。[2]这些成果是合成生物学领域的里程碑式进展，大大推进了对生命奥秘的认知。合成生物学作为一种方兴未艾的具有颠覆性意义的新兴技术，已迅速发展为一门新兴的交叉学科，其重要的研究意义和巨大的应用前景引起了科学界乃至社会各界广泛的关注和讨论。

2017年科技部《“十三五”生物技术创新专项规划》指出，合成生物技术为颠覆性技术，要突破人工生命元器件、基因线路和生物计算、人工生命体，构建DNA合成与组装、生物计算与设计、元件木块底盘库共享平台，以及可生产化学品、材料、天然产物、生物能源的人工细胞工厂，抢占合成生物学战略制高点。针对合成生物学蓬勃发展的现状，及其巨大的应用前景和发展潜力，作为生命科学专业的本科生有必要对这一学科进行深入的了解。这门学科尽管建立时间不长，但发展极其迅猛，其理论研究意义和工业应用潜力已逐渐凸显。目前国内普通高校中面向生命科学相关专业本科生开设这门课程的不是很多，但许多国外一流高校（如MIT、哈佛大学等）以及有些国内985高校已经开始将其作为高年级本科生的专业课程。作为生命科学相关专业的教师，笔者认为将合成生物学作为的一门高级选修课程，面向生物工程、生物科学、生物技术等专业高年级本科生介绍这门新兴学科的学科理念、技术体系和应用价值等是极有必要的。鉴于植物学科在农林院校的优势地位，我们首先向学生介绍植物合成生物学课程。本文就植物合成生物学选修课程的实验部分的开设作一简要介绍。

合成生物学创新发展了一系列优秀的实验技术，从基本功能元件的构建与标准化，到高通量的微芯片基因合成技术与各种尺度（从bp至Mb）的DNA拼接组装方法，再到强大的基因组编辑工具，底盘细胞也因工具的不断创新得到了快速发展。微生物最小基因组的分析以及对基因组的连续删简优化，为构建一个具有可预测、可控制表型的优良底盘细胞奠定了基础，为促进基于细胞疗法的人类疾病治疗，哺乳动物细胞作为底盘细胞也正在开发中。[3]因此，要较好的消化理解这些全新的实验技术，理解和掌握合成生物学最核心的工程化、标准化理念，光靠纸上谈兵显然是不行的，因此，我们反复讨论了植物合成生物学课程实验的设计方案，对实验教学内容进行精心设计，力求在较短学时数内完成从转录单位的构建，多个转录单位的组装及在模式植物中的表达与检测的实验流程。

合成生物学是生物技术在分子生物学和基因工程层面上的自然延伸，可以说，基因工程和合成生物学是生物技术发展的两个阶段，前者是后者的基础。但二者并没有明确的界线，有相当一部分内容是重叠的。[4]因此，我们在设计实验课程时注意到了与分子生物学实验课程的关系，避免重复性教学。在基因工程的实施过程中一般只转移个别外源基因，而合成生物学通常是转移一组基因，涉及到代谢途径甚至代谢网络等。合成生物学的核心理念是标准化、系统化、工程化。它遵循标准化-设计-建模/模拟-实施-测试的工程学思想。合成生物学家力图通过工程化的方法，将复杂的生物系统合理简化拆分为各个功能元件，通过对生物元件的逐级组装，直至设计和构建具有崭新功能的合成生物系统。[5]

传统的多基因克隆系统往往涉及繁杂的克隆操作，基于IIs型限制性内切酶建立的克隆系统（如Golden Gate 、[6]Moclo、 [7]Golden Braid）[8-9]则具有独特的优势。[10]传统克隆方法所使用的II型限制性内切酶识别和切割回文序列（例如内切酶HindIII识别和切割AAGCTT）。而IIs型限制性内切酶识别的一般为非回文序列，切割反应在识别位点以外进行。基于IIs型内切酶的克隆方法就是在同一反应体系中，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开DNA的特性，产生符合设计者要求的粘性末端，最后通过连接酶将多个片段按设计要求“无缝”拼接成不含酶识别位点的DNA。本课程实验选用了已经在植物合成生物学领域得到了广泛采用的西班牙植物分子与细胞生物学研究所（IBMCP）Diego Orzaez教授实验室所建立的GoldenBraid系统。GoldenBraid系统是一种模块化的组装系统，对于启动子、编码序列、终止子等组件（GBparts）赋予不同的首尾部标记，通过两种IIs型限制性内切酶（BsaI和BtgzI）的交叉使用，GoldenBraid系统可以实现转录单位在两类载体中（LEVEL%Z和LEVEL%R載体）的来回组装以致无穷（类似于“编织”，固命名“Braid”），而仅仅取决于载体的容量。另一方面，由于有多种预制组件（如启动子，终止子，报告基因等）可以使用，大大减少了多基因组装所需的工作量。同时Diego Orzaez教授实验室也开发了网页工具可以在线辅助GoldenBraid组装（https：//gbcloning.upv.es/）。

因为荧光蛋白转化植物后，易于观察。本课程实验选用荧光蛋白基因（DsRed和GFP）作为操作对象，从内化、多部分组装、双向组装到转化植物，整个课程实验包括4个单元，共24学时。

（1）内化实验（domostication）：将DNA构件（称为GBpart或GBSpart）连入GoldenBraid2.0语法的过程称为内化。内化过程通常包括使用GB引物做PCR扩增目的DNA（词或者词组）以及将PCR产物通过BsmBI限制-连接反应连入pUPD2载体。如果目的DNA内部含有BsaI、BsmBI及BtgZI识别位点，还应通过PCR反应来去除上述酶切位点。我们内化的是DsRed基因和GFP基因。

（2）multipartite assembly：多部件组装，将DNA构件（荧光蛋白基因）连入pUPD2后，还需将其与启动子及终止子组成转录单位（transcription unit， TU）。选择符合语法（前后缀匹配）的GB parts，通过BsaI或BtgZI/BsmBI酶切-连接，可将各个构件分别连入目标载体（destination vector， pDGB）pDGB alpha或pDGB omega，组装为pDGB1alpha1-35s_GFP_Tnos（TU1）和pDGB1alpha2-35s_DsRed_Tnos（TU2）。

（3）二元组装：本课程实验是要在烟草中同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，因此还需要将第2个实验单元组装的转录单位进一步组装在一起。如果要组装多个转录单位，可以通过两两组装的方式来进行。通过BsaI酶切-连接，可将上述两个转录单位组装入pDGB1omega1载体，构建为pDGB1omega1_TU1：TU2。如果需继续组装第3个转录单位，须将TU3连入pDGB1omega2 （pDGB1 omega 2_TU3）。通过BsmBI酶切-连接，在一个试管内加入pDGB1omega1_TU1：TU2、pDGB1omega2_TU3及pDGB1alpha1，则组装为pDGB1alpha1_TU1：TU2：TU3，以此类推可一直组装下去。

（4）转化植物：由于pDGB1是基于pGreenII骨架构建的，所以pDGB1omega1_TU1：TU2可以直接转化农杆菌（c58（pSoup）），然后通过农杆菌介导的方式，采用注射法转化本生烟草（Nicotiana benthamiana）叶片。需在实验前提前一个月左右安排學生播种烟草，以便到时有烟草可以使用。一般转化1周后，可以观察到红色荧光蛋白的表达，通过手持式紫外灯还可以观察到GFP的表达。

21世纪是生命科学的时代，而生命科学转化为实用技术最有前途的桥梁之一就是合成生物学。我国正处于建设创新型国家的关键时期，合成生物学等高技术产业的发展在国民经济的发展中毫无疑问将起到重要的作用。我国在合成生物学领域的起步比西方发达国家晚，但近年进步极快。很多高校都开设了合成生物学相关的课程，相信随着我国在合成生物学领域人才培养体系的不断完善，越来越多的优秀科技创新人才会走上岗位，极大推动我国的合成生物学产业的发展。本文对我校建设植物合成生物学课程实验的探索做了介绍，学生们普遍反响收获很大。合成生物学实验教学体系应坚持以培养学生创新能力为出发点，通过严谨科学的态度和扎实细致的工作，最终形成卓有成效的合成生物学领域创新人才培养模式，为建设创新型国家培养大批科技创新人才。

参考文献

[1] D. G. Gibson， J. I. Glass， C. Lartigue， V. N. Noskov， R. Y. Chuang， M. A. Algire， G. A. Benders， M. G. Montague， L. Ma， M. M. Moodie， C. Merryman， S. Vashee， R. Krishnakumar， N. Assad-Garcia， C. Andrews-Pfannkoch， E. A. Denisova， L. Young， Z. Q. Qi， T. H. Segall-Shapiro， C. H. Calvey， P. P. Parmar， C. A. Hutchison， 3rd， H. O. Smith， and J. C. Venter， Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science， 2010. 329（5987）：p.52-6.

[2] C. A. Hutchison， 3rd， R. Y. Chuang， V. N. Noskov， N. Assad-Garcia， T. J. Deerinck， M. H. Ellisman， J. Gill， K. Kannan， B. J. Karas， L. Ma， J. F. Pelletier， Z. Q. Qi， R. A. Richter， E. A. Strychalski， L. Sun， Y. Suzuki， B. Tsvetanova， K. S. Wise， H. O. Smith， J. I. Glass， C. Merryman， D. G. Gibson， and J. C. Venter， Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science， 2016.351（6280）：p.aad6253.

[3] 李雷，姜卫红，覃重军，薛小莉，芦银华.合成生物学使能技术的研究进展.中国科学：生命科学，2015（10）.

[4] 张春霆.合成生物学研究的进展.中国科学基金，2009.23（2）：65-69.

[5] 张柳燕，常素华，王晶.从首个合成细胞看合成生物学的现状与发展.科学通报，2010.55（36）：3477-3488.

[6] C. Engler， R. Kandzia， and S. Marillonnet， A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability. PLoS One，2008.3（11）：p.e3647.

[7] E. Weber， C. Engler， R. Gruetzner， S. Werner， and S. Marillonnet， A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One，2011.6（2）：p.e16765.

[8] A. Sarrion-Perdigones， E. E. Falconi， S. I. Zandalinas， P. Juarez， A. Fernandez-del-Carmen， A. Granell， and D. Orzaez， GoldenBraid： an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One，2011.6（7）：p.e21622.

[9] A. Sarrion-Perdigones， M. Vazquez-Vilar， J. Palaci， B. Castelijns， J. Forment， P. Ziarsolo， J. Blanca， A. Granell， and D. Orzaez， GoldenBraid 2.0：a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology.Plant Physiol，2013.162（3）：p.1618-31.

[10] N.J.Patron，DNA assembly for plant biology： techniques and tools.Curr Opin Plant Biol，2014.19：p.14-9.