添加Triton X-100 提高Streptococcus equisimilis FE-11 发酵透明质酸产量和分子量的研究

刘金龙，李志敏 ，赵国群，孙锡友 ，任媛媛

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050000）

透明质酸是由葡萄糖醛酸与N- 乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位重复连接而成的生物多糖，分子量显著影响其理化性质和应用效果。高分子量透明质酸具备优异的保湿性、粘弹性以及润滑作用，被广泛应用于医药及化妆品领域[1-2]。微生物发酵法是目前透明质酸的主要生产方法，但是在工业生产中如何实现高产量的同时保证高分子量仍是一个难题，实际上附加值较高的高分子量透明质酸产品，占发酵总产量的比例并不高[3]。为解决这一问题，国内外学者围绕高分子量透明质酸的合成机制，从不同角度和层次展开研究。

已有报道证明微生物培养环境与营养条件显著影响透明质酸产量和分子量的高低。溶氧水平对透明质酸产量和分子量影响显著，较高的溶氧水平有利于高分子量透明质酸的高效合成，但发酵体系较高的搅拌转速产生的剪切力会对透明质酸合成产生负面影响，进而影响透明质酸的产量和分子量；另外高溶氧衍生的氧自由基也会对透明质酸产量和分子量产生不利影响[4]。Jagannath 等研究证实培养温度是影响透明质酸产量和分子量的另一个显著因素，低温环境不利于菌体生长，但却有利于高分子量透明质酸的合成[5]。此外，Pires 研究团队的报道证实较高浓度的碳源以及添加前体物质有利于高分子量透明质酸的合成，但较高浓度有机氮源会导致透明质酸产量和分子量的下降[6]。

除了培养环境和营养条件，微生物发酵生产胞外产物的效率往往受到细胞膜通透性的制约，增大细胞膜通透性可以降低胞外产物的分泌阻力，促进产物的跨膜运输，解除产物反馈抑制效应，提高产物的合成效率[7-8]。透明质酸是典型的细菌胞外多糖，其胞内合成与向胞外分泌过程在时空上紧密关联。透明质酸糖链在胞内合成的同时，向胞外分泌延伸，而其跨膜分泌延伸的过程受到细胞膜流动性和通透性的制约，因此透明质酸的产量和分子量与细胞膜流动性和通透性紧密相关[9]。为了提高透明质酸的产量和分子量，本文系统考查了表面活性物质Triton X-100 添加浓度、添加时机对Streptococcus equisimilis FE-11 发酵透明质酸产量和分子量的影响，确定了最优的添加策略，并在此基础上比较了Triton X-100 添加与否对细胞膜结构组成的影响，印证了细胞膜流动性和通透性对透明质酸合成的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

本研究采用的菌株Streptococcus equisimilis FE-11由河北省发酵工程技术研究中心保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

脑心浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，氯化钠5 g/L，K2HPO42.5 g/L，自然pH，琼脂20 g/L，121℃灭菌15 min。

1.2.2 种子培养基

葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，调pH=7.0，121℃灭菌15 min。

1.2.3 发酵培养基（三角瓶）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO410 g/L，调pH=7.0，121℃灭菌15 min。

1.2.4 发酵培养基（发酵罐）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，调pH=7.0，121℃灭菌15 min。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养

将1～2 环斜面种子培养物接种至装有100 mL 种子培养基的500 mL 三角瓶中培养，摇床转速250 rpm，温度37℃，培养12～14 h。

1.3.2 发酵培养（三角瓶）

将5 mL 种子培养液接种至装有100 mL 发酵培养基（三角瓶）的500 mL 三角瓶中培养，摇床转速250 rpm，温度37℃，培养24 h。

1.3.3 发酵培养（发酵罐）

5 L 发酵罐中添加发酵培养基体积为4 L，接种量为5%（V/V），温度37℃，通气量4 L/min，搅拌转速为400 rpm，发酵过程中通过流加氢氧化钠溶液控制pH=7。

1.4 菌体浓度的测定

采用紫外可见分光光度计法，将发酵终点的发酵液稀释一定倍数，在波长660 nm 处测其吸光度OD 值，根据吸光度与细胞干重关系式求得菌体浓度。

1.5 脂肪酸测定

采用Folch 法提取细胞膜磷脂，提取的磷脂经0.5 mol/L KOH-CH3OH 溶液皂化，然后在三氟化硼催化作用下进行甲酯化修饰，随后利用正己烷萃取甲酯化产物，萃取样品采用Sun 等人报道的方法进行脂肪酸分析测定[10]。

1.6 透明质酸浓度测定

采用Bitter-Muir 氏法测定透明质酸浓度[11]。

1.7 透明质酸相对分子质量测定

采用Laurent 特性粘度法测定透明质酸相对分子质量[13]。

2 结果与讨论

2.1 Triton X-100 添加浓度对透明质酸发酵产量和分子量的影响

图1 Triton X-100 添加浓度对透明质酸产量和分子量的影响

本研究发现S. equisimilis FE-11 发酵体系中添加表面活性剂Triton X-100 可以显著影响透明质酸产量和分子量。如图1 所示，在发酵初始阶段，向透明质酸的发酵体系中添加一定量的Triton X-100，考查其添加浓度对透明质酸产量和分子量的影响。在Triton X-100 添加终浓度从1 g/L 逐步上升至7 g/L 过程中，透明质酸分子量和产量呈现先升高后降低的趋势，当添加终浓度为3 g/L 时，透明质酸分子量和产量同时达到最高值，分别为1.98 MDa 和1.12 g/L。

2.2 Triton X-100 添加时机对透明质酸发酵产量和分子量的影响

Triton X-100 对透明质酸发酵的影响除了与添加浓度有关外，还与添加时机相关。为了考查Triton X-100添加时机对透明质酸产量和分子量的影响，将Triton X-100 以不同时间（第0 h、4 h、8 h、12 h、16 h）添加到透明质酸发酵体系中时，添加终浓度均为3 g/L，如图2 所示，透明质酸分子量呈现出先增加后下降的变化趋势，最高分子量出现在添加时间为4 h，达到了2.18 MDa；另一方面，透明质酸产量受Triton X-100 添加时机的影响，也呈现先升高后降低的趋势，最高值出现在添加时间为8 h 时，达到了1.23 g/L。

Triton X-100 对于S. equisimilis FE-11 发酵生产透明质酸的影响效果受到添加浓度和添加时机的双重制约，对透明质酸产量和分子量促进效果最好的添加时机发生在发酵过程的前半段。为了更为全面考查Triton X-100 对透明质酸发酵的影响，进一步系统比较了不同添加时机（第0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）和不同添加浓度（0 g/L、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L）对应的透明质酸产量和分子量，实验结果如表1 所示，透明质酸产量和分子量随着Triton X-100 添加时机和添加浓度变化而变化，二者变化趋势基本一致，并且Triton X-100 添加时机越早，透明质酸产量和分子量的最高值对应的Triton X-100 添加浓度越小；当添加时机较早时（第0 h 和2 h），透明质酸产量和分子量的最高值对应的Triton X-100 添加浓度均是3 g/L；当添加时机为第4 h 和6 h时，透明质酸产量和分子量的最高值对应添加浓度均是5 g/L；当添加时机为第8 h 和10 h 时，透明质酸产量和分子量的最高值对应添加浓度均为7 g/L；在全部实验批次中，透明质酸产量和分子量的最高值同时出现在当Triton X-100 添加浓度5 g/L，添加时机为第6 h 时，分别达到了1.35 g/L 和2.33 MDa。

图2 Triton X-100 添加时机对透明质酸产量和分子量的影响

表1 Triton X-100 添加浓度和添加时机对透明质酸产量和分子量的影响

2.3 5 L 发酵罐水平添加Triton X-100 对透明质酸产量和分子量的影响

为进一步确认添加Triton X-100 对透明质酸发酵产量和分子量的影响，在5 L 发酵罐水平上进行了验证。如图3 所示，在发酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L，与不添加Triton X-100 相比，透明质酸最终产量和分子量分别从3.65 g/L 和1.93 MDa 提高到4.21 g/L 和2.49 MDa，分别提高了15.34%和29.02%。

图3 5L 发酵罐水平添加Triton X-100 对透明质酸产量和分子量的影响

向微生物培养体系中加入表面活性剂可以改善微生物细胞的通透性，进而促进胞内物质的分泌和合成，这主要是由于表面活性物质改变了微生物细胞膜的流动性[7-8]。微生物细胞膜结构中饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸的比率很大程度上决定着细胞膜的流动性，二者比率越小，细胞膜流动性和通透性越强[8,12]。Nelmec 等在黑曲霉发酵生产多聚半乳糖醛酸酶的过程中，添加Tween-80 显著降低了细胞膜结构中饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸的比率，多聚半乳糖醛酸酶的产量提高了70%[13]。在本实验中，Triton X-100 的加入引起了S.equisimilis FE-11 细胞膜结构中饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸比率的变化。如表2 所示（脂肪酸种类由碳原子数∶不饱和键数表示），与不添加Triton X-100 相比，在发酵第6 h 添加5 g/L Triton X-100 引起S. equisimilis FE-11 细胞膜脂肪酸组成的变化：不饱和脂肪酸C14∶1，C16∶1，C18∶1，C18∶2 均出现不同程度的升高，而饱和脂肪酸C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0 均出现不同程度的降低，由此导致饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸的比率从0.80 降低至0.50，这一变化诱发了S. equisimilis FE-11 细胞膜流动性和通透性的改变，促进了长链透明质酸的跨膜分泌与合成，一定程度上揭示了Triton X-100 对透明质酸产量和分子量影响的内在诱因。

表2 添加Triton X-100 对S. equisimilis FE-11 细胞膜脂肪酸组成的影响

3 结论

Triton X-100 添加对S.equisimilis FE-11 发酵透明质酸产量和分子量的影响效果与添加量和添加时机相关；发酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L 可使透明质酸产量和分子量同时达到最高水平；5 L 发酵罐验证结果表明，该添加策略使透明质酸产量和分子量分别提升了15.34%和29.02%；透明质酸产量和分子量的提升伴随菌体细胞膜结构中饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸的比率而下降；Triton X-100 添加引起的菌体细胞膜结构改变，改善了细胞膜的流动性和通透性，促进了透明质酸产量和分子量的提高。