缬草萜内酯对体外诱导肝星状细胞增殖及氧化应激反应的影响

梁 群，邢金梅，何学斌

（1.浙江省杭州市大江东医院，浙江 杭州 311225；2.河北省保定市第二医院，河北 保定 071000；3.华中科技大学同济医学院附属梨园医院，湖北 武汉 430000）

缬草为败酱科的1种耐寒可开花植物，种类复杂繁多，主要分布于温带地区，在我国主要产于东北至西南的广大地区，大约有30种，作为1种传统草药材，早在古希腊时期就被人所认识，而在我国明代也有其使用记录。缬草入药部位主要为根和茎，其提取物中含有单萜、倍半萜、环烯醚萜、挥发油、生物碱等多种成分，具有抗焦虑［1］、抗抑郁［2］、治疗失眠［3］、抗肿瘤［4-5］、保肝［6］、护肾［7］等药理作用，但目前相关制剂的开发利用较少。

课题组前期采用缬草环烯醚萜所用的TLC、HPLC 法（英国药典、外文文献推荐）来检测国产缬草（采自神农架、鄂西北、鄂西南、陕南、川东、湘西、黔东南、新疆），虽然未发现环烯醚萜类缬草的标志性成分——缬草三酯和异缬草三酯，但发现了另外3种含有量相当高的物质，经过提取、分离、纯化，并经波谱分析鉴定结构，三者异羟肟酸铁反应呈阳性，提示为内酯类物质，暂命名为缬草萜内酯A、B、C。初步研究显示，缬草浸膏对 CCl4诱导的大鼠肝硬化有一定防治作用，而以上3种成分为其中的主要成分，故推测缬草萜内酯对肝纤维化也可能有一定的防治作用。目前，尚无关于缬草萜内酯体外抗肝纤维化作用的报道，故本研究探讨该成分对体外诱导肝星状细胞增殖及氧化应激反应的影响，并考察其对肝纤维化的保护作用及其机制。

1 材料

1.1 细胞 大鼠HSC-T6 细胞株，由上海中医药大学肝病研究所馈赠。

1.2 试剂 南美胎牛血清（批号 SV30087.02，美国HyClone 公司）；DMEM 培养基［赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司］；枸橼酸铁铵、微量丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；次氮基三醋酸二钠（NTA，批号N9877-5G）、四硝基偶氮唑盐（MTT）、秋水仙素（批号C9754）、胰酶（美国 Sigma 公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京防化研究院化工厂）。

1.3 仪器 二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma 公司，型号55651-950）；荧光倒置显微镜（日本 Nikon 公司，型号TE2000-S）；酶联免疫检测仪（香港基因有限公司，型号MX200）；台式自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司，型号TDZ4-WS）；精密移液器（德国 Eppendorf 公司）；水平摇床（沃德生物医学仪器公司，型号 WD-9405B）。

1.4 药物 缬草萜内酯提取物由华中科技大学同济医学院老年医药学研究所薛存宽教授提供，命名为缬草萜内酯A、B、C，含有量＞98%，复旦大学、北京师范大学分析测试中心经紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、质谱、DEPT、COSY 谱鉴定其化学结构。

2 方法

2.1 HSC-T6 培养 将冻存状态的HSC-T6 于37 ℃下快速复苏后，接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞长满单层（约2 d）后胰酶消化并传代，台盼蓝法测定细胞活力。

2.2 细胞增殖抑制实验 取对数生长期的HSC-T6，经清洗、消化、吹打混匀后取 50 μL 悬液，加入 6 mL 含 3% 小牛血清的DMEM 培养液中稀释，计数并调整细胞密度为1×104／mL，接种于 96 孔板，空白调零组不加细胞悬液，其余每孔100 μL，置于培养箱中培养至近单层贴壁后取出倾去培养液，分别加入稀释细胞悬液（正常对照组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、100、200、300、400 μg／mL 缬草萜内酯 A、B、C（实验组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA＋0.5 μg／mL 秋水仙碱（阳性对照组），平行 3 孔，继续培养 36 h 后弃上清液，每孔加入 MTT 溶液（5 mg／mL）20 μL，37 ℃ 下继续孵育 5 h，终止培养，离心（1 000 r／min）5 min 后吸弃孔内培养液，加入 150 μL DMSO，微量振荡器上振荡10 min 以使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪上在570 nm 波长处测定各孔光密度值（OD 值），平行测 3 次，记录中位值。

2.3 抗氧化应激实验 取对数生长期HSC-TC，清洗、消化、吹打混匀后取200 μL 悬液，加入12 mL 配制好的3%培养基中稀释，计数并调整细胞密度为5×105／mL，接种于24 孔板，每孔500 μL，置于培养箱中培养至近单层贴壁后取出，倾去培养液，加入稀释细胞悬液（正常对照组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、200、400 μg／mL 缬草萜内酯A、B、C（实验组）、稀释细胞悬液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50 μmol／L 维生素 E（阳性对照组），每孔加 200 μL 含药培养液，平行2 孔，继续培养36 h 后取上清液，按试剂盒说明书操作步骤检测上清液中SOD、MDA 水平。

2.4 统计学分析 通过SPSS 16.0 软件进行处理，数据用（）表示，组间比较采用单因素方差分析和 SNK-q 检验。P＜0.05 差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞活力 0.5%台盼蓝染色测定，细胞活力＞90%。

3.2 缬草萜内酯 A、B、C 对 HSC-T6 增殖的影响 表1显示，与正常对照组比较，模型组 HSC-T6 增殖明显（P＜0.01）；与模型组比较，缬草萜内酯 A、B、C 组 OD 值显著降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。

3.3 缬草萜内酯 A、B、C 对 SOD 活性、MDA 水平的影响 表2显示，与模型组比较，缬草萜内酯 A、B、C 组 SOD活性显著升高（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 缬草萜内酯 A、B 除外），并呈现剂量依赖性；与阳性对照组比较，缬草萜内酯 C 400 μg／mL 组其活性显著升高（P＜0.01）。

表3显示，与模型组比较，缬草萜内酯 A、B、C 组MDA 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 缬草萜内酯A、B 除外），并呈剂量依赖性；与阳性对照组比较，缬草萜内酯 C 400 μg／mL 组其水平显著降低（P＜0.05）。

表1 缬草萜内酯A、B、C 对HSC-T6 增殖的影响（）

表1 缬草萜内酯A、B、C 对HSC-T6 增殖的影响（）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01

组别OD 值缬草萜内酯A 缬草萜内酯B 缬草萜内酯C正常对照组 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2模型组 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△阳性对照组 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 400 μg／mL 组 0.568 9±0.009 6∗∗ 0.482 1±0.008 3∗∗ 0.418 1±0.005 7∗∗300 μg／mL 组 0.614 6±0.018 3∗∗ 0.563 1±0.014 8∗∗ 0.494 3±0.015 6∗∗200 μg／mL 组 0.701 0±0.018 1∗∗ 0.665 8±0.015 3∗∗ 0.603 7±0.022 5∗∗100 μg／mL 组 0.850 9±0.024 9 0.750 5±0.014 3∗∗ 0.694 0±0.023 7∗∗50 μg／mL 组 0.861 3±0.021 8 0.856 2±0.022 6 0.782 5±0.008 2∗∗

表2 缬草萜内酯A、B、C 对SOD 活性的影响

表3 缬草萜内酯A、B、C 对HSC-T6 培养液中MDA 水平的影响

4 讨论

肝纤维化是慢性肝脏疾病进展过程中的1 个必经环节，为所有慢性肝病的共同病理基础，其本质是肝组织对损伤发生的过度修复应答，导致瘢痕组织形成的病理过程，各种病因（病毒感染、酒精中毒、金属超负荷等）引起肝脏损伤的病理过程不同，但其所致肝纤维化的最终途径是相同，即肝星状细胞激活。大量研究表明，HSC 无论正常或病理状态下都是产生细胞外基质的主要细胞［8-10］，本实验所用的HSC-T6 是正常大鼠肝星状细胞，它与人类肝星状细胞（LX-2）在形态学特点、生长特点、标志物方面都比较接近，是肝纤维化研究的理想细胞系，再将其与FeNTA共同培养，采用铁超负荷法来制造氧化应激的模型。刘梅等［11］应用不同质量浓度的 FeNTA 培养大鼠肝 HSC，证实铁剂可引起后者增殖，导致氧化-抗氧化失衡；MTT 法检测HSC 的生长及存活率是 Mosmann［12］最早报道的，该方法操作简便，经济快捷，灵敏度高，重复性好，广泛用于生物因子活性的检测，故本实验选择该方法。

脂质过氧化反应在调节体内胶原基因表达的过程中起着主导作用，同时也是连接组织损伤和纤维化过程的纽带，抗氧化剂可通过作用于肝细胞、HSC、Kupffer 等多种细胞及环节来减慢或阻止肝纤维化的发展［13-14］。机体受到刺激后，引起酶和非酶系统平衡失调，导致大量氧自由基产生，后者主要攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，并形成大量脂质过氧化产物，如醛基（丙二醛MDA）、酮基、氢过氧基等。MDA 作为脂质过氧化反应的中间产物，间接反映了细胞受氧自由基攻击的严重程度，而其检测常与SOD 相互配合，后者间接反映了机体清除氧自由基的能力，对机体氧化-抗氧化平衡起到重要作用，故药物抗氧化作用越强，MDA 水平越低，SOD 活性越高。

维生素E 是1种脂溶性抗氧化剂，又名生育酚（包括α、β、γ、δ 4种类型），不但能清除 O2-·等氧自由基，也可与GPx 协同阻止脂质过氧化反应发生，同时还有抗纤维化的作用。Nieto 等［15］报道，HSC 活化后可表达细胞色素P450E1 调节ROS 产物，从而诱导 COLI 表达，而维生素 E处理过的细胞能破坏细胞色素P450E1；其他研究也发现维生素E 可降低α-SMA 表达，使胶原或四氯化碳损伤细胞中的蛋白质与MDA 形成加合物，表明它在机体抗氧化应激过程中发挥着不可或缺的作用，故本实验选择其作为阳性对照。

结果表明，缬草萜内酯 A（400、300、200 μg／mL）、缬草萜内酯 B（400、300、200、100 μg／mL）、缬草萜内酯C（400、300、200、100、50 μg／mL）对 HSC-T6 增殖均有一定抑制作用，并呈剂量依赖性；除50 μg／mL 缬草萜内酯A、B 外，其他不同质量浓度成分均有抗氧化作用，也呈剂量依赖性；成分质量浓度越高时，SOD 活性越高，MDA 水平越低；400 μg／mL 缬草萜内酯 C 的抗氧化作用强于50 μmol／L维生素 E。

综上所述，缬草萜内酯可抑制肝星状细胞增殖，并对机体氧化应激反应有一定保护作用，但该成分对肝纤维化的作用机制还有待进一步研究。