马甲子总三萜中2种成分油水分配系数的测定

任 娟孙 兴阮 佳谭 镭詹 雁徐超群∗

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 610075；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

马甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir 为鼠李科植物，在 《中药大辞典》 和一些地方习用志上多有记载，其性味苦、平、无毒，具有清热解毒、止痛活血之功效，可治疗跌打损伤、痈肿溃脓等症，化学成分主要是三萜、总黄酮、环肽等［1］，具有镇咳祛痰、抗溃疡、抗肿瘤等作用［2-4］。课题组前期对马甲子总三萜进行纯化分离，得到2 个单体化合物，分别为2α，27-二反式对羟基肉桂酰氧基-白桦脂酸和白桦脂酸，其中前者为新化合物，命名马甲子素［5］；后者具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗 HIV 等多种活性，有很好的发展前景［6］，由于前者是以后者为母核的五环三萜类化合物，故推测它可能具有抗肿瘤活性，并发现其抗肿瘤活性更强［7］。为了将马甲子总三萜制成安全、有效、质量可控的药物，本实验测定该成分中马甲子素、白桦脂酸的油水分配系数，为相关制剂开发奠定基础。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；THZ-103B 恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；BSA224S 分析天平（德国赛多利斯公司）；3K15 低温高速离心机（美国Sigma 公司）；SB5200D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

马甲子素对照品（自制，含有量≥98%，批号20150801）；白桦脂酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号 111802-201402）；马甲子总三萜（自制，批号 20171008）。马甲子（多年生）于2017年7月采自四川省双流县牧马山，经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为鼠李科马甲子属植物马甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir。乙腈为色谱纯（美国Sigma 公司）；十二烷基硫酸钠（德国 Clariant 公司，批号 DEA4004255）；正辛醇、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯。

2 方法

2.1 马甲子素、白桦脂酸含有量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，98% A；5～55 min，98%～0A）；体积流量 1.0 mL／min；柱温 30 ℃；检测波长 320 nm；ELSD 漂移管温度 45 ℃；进样量 10 μL；马甲子素、白桦脂酸分别用 DAD、ELSD 检测器检测，色谱图见图1。由图可知，该色谱条件下各成分分离度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取马甲子素、白桦脂酸对照品适量，置于50 mL 量瓶中，甲醇超声溶解定容，制得质量浓度分别为0.502 0、0.935 0 mg／mL的贮备液，再分别将其稀释成0.050 2、0.025 1、0.012 6、0.006 3、0.003 1、0.001 6 mg／mL，以及0.935 0、0.467 5、0.233 8、0.116 9、0.058 4、0.029 2 mg／mL，即得。

2.1.3 线性关系考察 将马甲子素对照品溶液在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为Y=2.684 6×103X＋1.097 7（r=0.999 8），线性范围 1.6～50.2 μg／mL。将白桦脂酸对照品溶液在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，以质量浓度的对数值为纵坐标（lgY），峰面积的对数值为横坐标（lgA）进行回归，得方程为 lgM=1.320 7lgA＋2.420 7（r=0.999 5），线性范围29.2～935.0 μg／mL。

2.1.4 精密度试验取 0.006 3、0.42 mg／mL 马甲子素、白桦脂酸对照品溶液各 10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得两者峰面积 RSD 分别为1.80%、2.42%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一批供试品溶液，在“2.1.1”色谱条件下于 0、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL 测定，测得马甲子素、白桦脂酸峰面积RSD 分别为 1.24%、1.08%，表明溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验 精密称取含有量已知的马甲子总三萜0.005 8 g（相当于马甲子素0.040 6 mg、白桦脂酸3.350 2 mg）6 份，精密加入对照品溶液（马甲子素 0.020 7 mg／mL、白桦脂酸 1.68 mg／mL）各2 mL，按 “2.1.3”项下方法制备溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，马甲子素、白桦脂酸平均加样回收率分别为101.32%、98.47%，RSD 分别为2.85%、3.01%。

2.2 溶解度测定 精密称取马甲子总三萜0.1 g，共 11 份，置于11 个10 mL 具塞试管中，精密加入蒸馏水、40%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正辛醇、0.5% 吐温-80、0.5%十二烷基硫酸钠各5 mL，置于恒温振荡器中，（37±0.5）℃下 120 r／min 振摇 24 h 以充分溶解，其间始终保持具塞试管中有固体药物。然后，将药物转移至离心管中，10 000 r／min 离心10 min，取上清液过滤，在 “2.1.1”项色谱条件下测定溶解度，结果见表1。由表可知，白桦脂酸、马甲子素在蒸馏水中的溶解度较低，以至于无法测定；随着乙醇体积分数增加，两者溶解度逐渐增大；加入表面活性剂（吐温-80、十二烷基硫酸钠）后，也可改善其溶解度。

表1 马甲子素、白桦脂酸溶解度测定结果Tab.1 Results of solubility determination of paliurusene and betulinic acid

2.3 油水分配系数测定

2.3.1 正辛醇饱和的磷酸盐溶液（水相）、水饱和的正辛醇溶液（油相）制备 根据2015年版《中国药典》 附录中的配制方法，分别制备pH 6.8的磷酸盐缓冲液、人工胃液、人工肠液、0.1 mol／L氢氧化钠溶液，再取适量磷酸盐缓冲液，稀释后的 0.1 mol／L 磷酸调节 pH 至 2.5、3、4、5、6，0.1 mol／L 氢氧化钠溶液再调节其至 7、8。然后，取100 mL 不同pH 的磷酸盐溶液、人工胃液、人工肠液、蒸馏水，置于500 mL 锥形瓶中，加入100 mL 正辛醇，室温下振摇 24 h，静置过夜，分取上层（油相）和下层（水相）。

2.3.2 油水分配系数-时间曲线绘制 采用经典摇瓶法。精密称取马甲子总三萜适量于量瓶中，“2.3.1”项下油相溶解稀释，移取 10 mL 稀释后油相和1 mL 水相于具塞试管中，恒温摇床上振摇（室温，120 次／min），于 2、4、6、8、10、12、24 h取样，10 000 r／min 离心 10 min，过滤，取续滤液适量，在 “2.1.1”项色谱条件下测定马甲子素、白桦脂酸含有量C1，计算油水分配系数P，公式为P=10×C1／（C0-C1）（C0为药物在油相中的初始浓度，C1为平衡后药物在油相中的浓度），绘制油水分配系数-时间曲线，结果见表2～3、图2～3。由此可知，pH 为 2.5、6、7 时，白桦脂酸油水分配平衡时间为 8 h；pH 为 2.5、4、5、8 时，蒸馏水、人工胃液、人工肠液中白桦脂酸油水分配平衡时间为 10 h；pH 为 5、6 时，蒸馏水、人工胃液中马甲子素油水分配平衡时间为8 h；pH 为2.4、3、4、7、8 时，人工肠液中马甲子素油水分配平衡时间为10 h，表明振摇时间应大于10 h 以保证药物在充分分配平衡。

图2 白桦脂酸油水分配系数-时间曲线Fig.2 Oil-water partition coefficient-time curves for betulinic acid

2.4 不同pH 下油水分配系数测定［8-10］精密称取马甲子总三萜适量，置于量瓶中，用 “2.3.1”项下不同pH 油相溶解稀释，移取10 mL 稀释后的各油相和1 mL 各水相于具塞试管中，置于恒温摇床上振摇 10 h（室温，120 次／min），10 000 r／min 离心 10 min，过滤，取续滤液适量，在 “2.1.1”项色谱条件下测定马甲子素、白桦脂酸含有量，计算两者油水分配系数，结果见图4、表4。

表2 时间对白桦脂酸油水分配系数的影响（n=3）Tab.2 Effect of time on oil-water partition coefficient of betulinic acid（n=3）

表3 时间对马甲子素油水分配系数的影响（n=3）Tab.3 Effect of time on oil-water partition coefficient of paliurusene（n=3）

图3 马甲子素油水分配系数-时间曲线Fig.3 Oil-water partition coefficient-time curves for paliurusene

3 讨论

大部分药物的溶解度参数（δ）范围为8～12，而正辛醇为10.24，恰好处在中值附近，并与细胞膜溶解度参数（10.3）非常接近，这使得药物在该溶剂中可形成近似理想的溶液。另外，正辛醇相较于其他惰性溶剂具有更好的极性和溶解性，药物在分配过程中更容易进入其中，从而更加便于测定，故选择该溶剂作为油相。课题组前期测定了马甲子总三萜在水、磷酸盐缓冲液中的饱和溶解度，发现马甲子素、白桦脂酸溶解度较低，HPLC 法无法测定其含有量，再将油相、水相等体积混合，发现由于两者水溶性均较差，导致测定结果误差大，最终确定油相、水相比例为10 ∶1，此时稳定性大大提高。

图4 pH 值对白桦脂酸、马甲子素油水分配系数的影响Fig.4 Effects of pH values on oil-water partition coefficients of betulinic acid and paliurusene

表4 pH 值对白桦脂酸、马甲子素油水分配系数的影响（n=3）Tab.4 Effects of pH values on oil-water partition coefficients of betulinic acid and paliurusene（n=3）

药物在体内的溶解、吸收、分布、转运与其水溶性、脂溶性，即油水分配系数（P）有关［11］，药物通过细胞膜时需要特定疏水性、亲水性，而lgP可作为预先判断药物在肠道中吸收情况的重要依据。其中，lgP＜0 时药物水溶性太强，肠道中不容易被吸收；lgP＞5 时，药物脂溶性太强，导致很难从细胞膜内侧释放；0＜lgP＜5 时，可从胃肠道给药吸收，而且在 1～3 时药物吸收较为理想［12-14］。本实验发现，马甲子总三萜中白桦脂酸、马甲子素的 lgP分别为 2.91～3.15、1.96～2.13，在 0～5 范围内，表明两者均可用于胃肠道药物吸收，而且后者胃肠道吸收能力可能更强。

根据前期预实验及相关文献可知，马甲子总三萜中主要化学成分的溶解度较小，但本实验发现其中的主要化合物具有良好的胃肠道吸收能力，是属于低溶解度具有一定渗透性的药物。因此，将马甲子总三萜制成口服药物时，应注意提高药物在体内的溶出，可考虑制成固体分散体［15］、包合物［16］、微乳［17］等。