急性心肌梗死病人血清miR-208a、miR-208b、miR-1水平变化及其临床意义

急性心肌梗死(AMI)是常见的心血管急症，国内报道近年来我国年轻男性、农村人群AMI发病率有逐渐增高的趋势[1]。AMI的早期快速诊断有利于临床医生对病人进行危险分层，并且有助于及时进行再灌注治疗[2]。因此，有必要探索AMI的新型生物标志物。微小RNA(micro RNA，miR)是内源性的长度20～25个核苷酸非编码RNA，通过与mRNA的特异性结合，诱导mRNA降解或抑制翻译过程，发挥基因表达的转录后调节作用。目前人类中鉴定出超过2 000种miRNA，至少1/3的人类蛋白质编码基因由miRNA调节。miRNA参与多种基本生物过程，包括增殖、分化、组织再生和衰老等过程[3-4]。miRNA在组织中的异常表达会导致各种疾病，如癌症和心血管疾病等[5]。此外，许多miRNA表现出组织特异性分布的特点，并且稳定存在于血清中，因而，循环miRNA是一种有潜在疾病诊断的生物标志物[6]。目前在AMI病人血浆中发现多种miRNA，如miR-208、miR-499和miR-1等表达升高的现象[7]，提示心脏特异性miRNA可以从受损心肌细胞释放到血液循环中。本研究应用实时定量PCR法(qT-PCR)对AMI病人及正常对照人群血清中miR-208a、miR-208b及miR-1进行检测，并初步分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月—2018年3月宜城市中医医院诊治的103例AMI病人(AMI组)及80名健康查体者(对照组)。AMI组男73例，女30例，年龄36～71岁；对照组男62名，女18名，年龄38～72岁。AMI组病人发病到就诊的时间小于1 h。

AMI病人纳入标准：胸痛持续10 min以上且发作12 h以内；心电图异常，ST段抬高0.1 mV；血清学标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)升高大于正常值两倍。排除标准：①严重肝肾功能障碍；②合并严重感染；③合并自身免疫系统疾病；④合并恶性肿瘤。所有病人及家属均知情同意并签字，本研究经宜城市中医医院伦理委员会审核批准(编号：L/LNHY-YZ-L005)。

1.2 方法 检测AMI病人胸痛发作后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h及7 d时病人血清miR-208a、miR-208b及miR-1表达水平。留取各时间点静脉血液标本3 mL，置于EDTA抗凝管中，4 ℃下2 000 r/min离心20 min后，取上清(血清)置于-80 ℃冰箱保存。采用实时定量PCR法(qRT-PCR)对血清中miR-208a、miR-208b及miR-1进行检测。采用RNAisoTMPLUS试剂盒(Takara公司)提取血清总RNA，应用miScript逆转录试剂盒(Ambion公司)合成cDNA。总反应体系为15 μL，反应条件：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。逆转录引物miR-208a引物序列正向：5′-TGCGGTATAAGACGAGCAAA-3′，反向：5′-ATTCCATGTTGTCCACAGTCTCC-3′；miR-208b引物序列正向：5′-GGGAUAAGACGAACAAAAG-3′，反向：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，miR-1引物序列正向：5′-GGCGGTGGAATGTAAAGAAGT-3′，反向：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。内参基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游序列：3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。SYBR Green PCR试剂盒检测血清miR-208a、miR-208b及miR-1含量，以U6作为内参照。采用2-△△CT法计算血清中miR-208a、miR-208b及miR-1的相对表达水平。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所有AMI组病人血清cTnI、CK-MB水平，实验操作步骤按照试剂盒(购自上华生物技术有限公司)说明书进行。

2 结 果

2.1 两组病人一般资料比较 两组在年龄、性别、血糖、收缩压、舒张压、饮酒史及吸烟史方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。

表1 两组病人一般资料比较

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.2 两组miR-208a、miR-208b及miR-1表达水平比较 AMI组在胸痛发生后3 h血清miR-1、miR-208a及miR-208b的相对表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组miR-208a、miR-208b及miR-1表达比较(±s)

2.3 AMI组血清miR-208a、miR-208b及miR-1表达变化 血清miR-1在胸痛发作1 h明显升高，12 h达到峰值，7 d降至正常水平；miR-208a在胸痛发作1 h明显升高，3 h达到峰值，7 d降至正常水平；miR-208b胸痛发作1 h明显升高，12 h达峰值，7 d降至正常水平。详见图1。

图1 AMI组血清miR-208a、miR-208b及miR-1表达变化

2.4 两组血清cTnI、CK-MB表达比较(见表3) AMI组胸痛3 h、12 h cTnI、CK-MB均高于对照组(P<0.01)，12 h cTnI、CK-MB达峰值，与3 h比较差异有统计学意义(P<0.01)。

组别时间例数cTnICK-MB对照组1031.12±0.31 1.24±0.63 AMI组胸痛3 h803.43±1.431) 5.23±2.011) 胸痛12 h80101.82±74.351)2) 73.54±23.171)2)

与对照组比较，1)P<0.01；与同组胸痛3 h后比较，2)P<0.01

2.5 AMI组血清miR-208a、miR-208b及miR-1与cTnI、CK-MB的相关性 miR-208a、miR-1及miR-208b与cTnI呈显著正相关(r=0.417，P=0.007；r=0.381，P=0.010；r=0.583，P=0.004)。血浆miR-208a、miR-1及miR-208b与CK-MB呈显著正相关(r=0.435，P=0.008；r=0.712，P=0.001；r=0.883，P=0.003)。

3 讨 论

急性心肌梗死是由于冠状动脉急性闭塞导致血流中断，心肌细胞缺血、死亡甚至引发心力衰竭或死亡的心血管疾病。早期诊断并予以有效的治疗有助于改善病人预后，降低死亡率。cTnI、CK-MB是目前临床常用的诊断AMI的生物标志物[8]。然而，cTnI达峰时间多发生于发病后12～48 h，并且其升高程度与病情程度不一致。为进一步早期诊断AMI，有必要寻找新型的具有高特异性和灵敏度的生物标志物。理想的AMI生物标志物应在心脏组织中特异性表达且在正常条件下外周循环中的表达水平极低或不可检测。此外，当心肌细胞受损时，其可从心脏组织中迅速释放到循环中并且稳定地表达一段时间。近年来研究表明，心血管系统疾病(如心力衰竭、心肌梗死、冠心病等)发生时常伴有外周循环血miRNA水平改变[9]。

miR-208a和miR-208b都是心脏组织特异性miRNA，本研究结果显示，与对照组相比，AMI组病人血清miR-208a及miR-208b的相对表达水平显著增高，与以往报道一致[10-11]，表明这两种miRNA可能是AMI的潜在生物标志物。有研究表明miR-208a在非AMI病人中检测不到，但90%的AMI病人中可在4 h内检测到[12]。因而本研究进一步观察AMI组病人不同时间点时血清miR-208a及miR-208b变化，结果显示心肌梗死1 h血清miR-208a明显升高，3 h达到峰值；miR-208b心肌梗死1 h明显升高，12 h达到峰值。与cTnI及CK-MB相比，两者可以检测到的明显升高的时间明显较短，表明miR-208a和miR-208b释放入循环血更快，有利于AMI的早期诊断。国外学者研究表明，miR-208a高表达组的生存率明显低于低表达组，其机制与miR-208a能调节肌球蛋白重链(MHC)基因的表达，进而影响心肌胚胎干细胞的分化，参与心肌纤维化和肥大过程有关[13]。国内研究表明，冠状动脉三支病变病人血清miR-208b表达明显高于双支和单支病变，有利于判断AMI病情程度、梗死面积及再灌注治疗效果的预测，并且血清高水平miR-208b与较高的左心室重构风险有关。人类miR-1具有两种异构体(miR-1-1和miR-1-2)，序列相同但由不同的基因编码组成。miR-1在心肌细胞和骨骼肌细胞中高度表达，并且与心脏发育和心脏疾病密切相关[14]。研究表明，在AMI发作后可以检测到循环miR-1的水平升高，有助于急性心肌梗死的早期诊断和鉴别非急性心肌梗死和心绞痛等疾病[15]。本研究中，AMI组病人血清miR-1显著高于对照组，并且在miR-1胸痛发作1 h明显升高，12 h达峰值，与以往研究结果一致[16]，表明miR-1可能参与AMI的发生。有研究表明miR-1可抑制热休克蛋白(HSP)活性，抑制线粒体功能，促进细胞凋亡。在缺血/缺氧心肌细胞中，通过RNA干扰抑制miR-1表达可以减少细胞凋亡，具有心脏保护作用，增加对氧化应激的抵抗能力，并减少自发性心律失常[17]。荟萃分析结果表明，汇总敏感度和特异度分别为0.73、0.82，AUC为0.84，表明miR-1敏感度虽低，但具有较高的诊断准确性[18]。本研究中，AMI组病人血清miR-208a、miR-208b及miR-1与cTnI、CK-MB呈正相关，表明miR-208a、miR-208b及miR-1有可能成为新的诊断AMI和评估AMI严重程度的生物学标志物。

综上所述，AMI病人血清miR-208a、miR-208b及miR-1水平升高，与cTnI、CK-MB呈正相关，有可能成为AMI诊断和预后的潜在的新型标志物。