相位对比磁共振定量血流测定技术评价动脉粥样硬化

施豪波，余一凡，罗苑芬，马 玲，王余峰，欧阳寒明，陈茂东，张向群南方医科大学中西医结合医院，广东 广州 5035；南方医科大学生物医学工程学院，广东 广州 5055

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管事件及外周血管性疾病的基本病理学基础，准确检测粥样硬化斑块的形成是防治心脑血管疾病发生的关键，动脉血流导致不稳定的流体动力学在动脉粥样硬化形成有明显相关性[1-4]。其中，动脉局部血管壁切应力（WSS）作为一项重要的血流动力学因素，其相关参数与动脉粥样硬化之间的相关性已经有研究证实[5-8]。目前，常用磁共振血管成像技术[9]、高分辨率磁共振成像[10]、三维容积各向同性快速自旋回波[11]、超声等技术对AS进行评估，但上述方法均无法测量血管内整个横截面上的平面速度的空间分布[12-13]。PC-MRI技术可以利用血液流动产生的相位变化测量血流速度，既能显示血管解剖结构，又能提供血流方向、血流速度及流量等血流动力学信息[14-15]。因此，可以利用PCMRI和计算流体力学方法分析、评估动脉血流动力学在动脉粥样硬化形成过程中的作用[16]。既往研究均采用体外理想化模型，同时量化WSS[12]，无法模拟复杂的人体内环境。本研究拟通过建立动物模型，模拟实际个体之间的解剖和流动环境，通过PC-MRI技术分析及评估在体的血流动力学与动脉粥样硬化之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购买南方医科大学动物实验中心健康新西兰白兔13只，6月龄，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半。本实验已获得南方医科大学中西医结合医院伦理委员会审核并通过。

1.2 动物模型的建立

高胆固醇饲料配方：蛋黄粉（14%）,猪油（5%）,胆固醇（1%）；基础饲料配方：粗蛋白（21.1%）、粗纤维（10.3%）、粗灰分（7.4%）、水分（9%）、钙（1.3%）、磷（0.73%）；以上饲料均由南方医科大学实验动物中心提供。

喂养方式：动物适应环境2周后，随机分为A、B、C、D、E组，每组2～3只，再高胆固醇饲料喂养2、3、4、5、6月。每组给料量相同,为120～150 g/d；分2次喂料，1次/12 h，自由饮水。

1.3 PC-MRI检测动脉粥样硬化

所有兔子PC-MRI检查扫描前均抽7 mL血进行检验，观察血脂变化。所有PC-MRI检查均在1.5 T扫描仪（Signa Excite，GE Medical Systems）上完成，用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉，使用回顾性心电门控，使数据采集涵盖整个心动周期，促发延迟时间选择最短。先行定位扫描，再行2D快速电影PC序列扫描，扫描参数：TR/TE=自动选择最小重复时间/最小回波时间，翻转角20°，视野20 cm×20 cm，矩阵256×256，ETL：1，激励次数：1，带宽31.25 kHz，扫描层厚7 mm,扫描时相60。模拟心率选择230次/min。固定相位编码数值为150 cm/s，固定相位编码方向为Slice，将实际流速设定为150 cm/s为中位值，向上、向下分别递增、递减10%，递增、递减各4组，共获得60组流速测定数据。以兔肾动脉分叉上方1 cm处主动脉为靶血管，采用PC-MRI定量血流测定技术,运用以上校正后的参数进行扫描。

1.4 MRI血流数据分析

使用南方医科大学生物医学工程学院的血流动力学参数处理软件对所得包含血流动力学信息的图像进行后处理。首先在相位图上勾画血管边界，将容差值（最大信号强度与血管边界像素的信号强度之差）设为80%，计算机根据信号阈值的差别自动找到边界点，拟合为圆形。将此设为血管的初始边界，并自动复制至相应时相的相位图上。进而应用相位图进行动脉血流参数的计算，包括血管断面面积、每时相最大速度、平均血流速度、及瞬时血流速度。利用MATLAB软件绘出时间－流率曲线。血流率最大值、最小值所在时相对应为收缩峰值期和舒张末期。以合作单位建立的三维抛物面模型血流分析软件和WSS计算方法为基础，精确计算靶血管WSS。

1.5 病理标本的制作

第2月解剖A组兔辅主动脉全程，取材于兔肾动脉分叉上方1 cm处的主动脉，采用冷冻切片常规HE染色方法，5 μm不连续切片，4 ℃冰丙酮同定30 s水洗，苏木精液染色40～60 s后水洗5～10 s（必要时1%盐酸酒精分化温水返蓝），伊红滴后速洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，每条动脉组织随机抽取4张切片，光镜下观察血管壁细胞核的形态及分布，用AutoCad图像分析软件测量血管内径、壁厚和壁厚内径比。第3月按上述方法处理B组兔，以此类推，第6月处理E组兔；染色后切片由病理学专家判断有无斑块形成。

1.6 统计学处理

利用SPSS20.0统计软件进行分析处理，利用PCMRI获得的各组数据，着重分析高脂喂养前、后兔主动脉壁WSS之间的差异，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂的变化

兔的正常血胆固醇1.59 mmo/L，甘油三酯1.99 mmol/L，高密度脂蛋白0.39 mmol/L，低密度脂蛋白0.62 mmol/L。5只兔于高脂喂养、麻醉过程中死亡，死亡后解剖病理为脂肪肝、腹水。剩余8只经耳缘静脉采血验血胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白（表1），按喂养时间排序。

2.2 空白组及实验组的PC-MRI检测结果

利用PC-MRI获得的兔主动脉血流信号后处理得高脂喂养前、后主动脉壁WSS的大小，并与其相对应主动脉AS程度（按喂养时间排序）。对照组的WSS为（17.03±1.14）×10-2Pa，实验组兔的WSS为（28.79±3.50）×10-2Pa，对照组与实验组主动脉WSS差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。对照组兔流速12.28±2.51 cm/s，实验组兔流速22.31±6.24 cm/s，两组差异有统计学意义（F=3.19，P=0.01，表3）。对照组与实验组主动脉的血流率差异无统计学意义（4.51±1.13 mL/svs5.79±1.89 mL/s，F=0.66，P=0.24，表4）。

表1 兔血中胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的变化（mmo1/L）

表2 兔高脂喂养前、后主动脉壁WSS的比较及病理对照表

表3 兔高脂喂养前、后主动脉血流平均流速比较（cm/s）

表4 兔高脂喂养前、后主动脉血流率比较（mL/s）

C2兔高脂喂养前血流呈层流分布，最大血流流速位于管腔中心；高脂喂养后最大血流流速大于高脂喂养前最大血流流速，高脂喂养后血流流速分布中心发生偏移；三维血流流速图可以更直观观察（图1）。

图1 C2兔高脂喂养前、后血流流速分布的重构图形及主动脉横轴位图

2.3 病理标本的观察

13只兔高脂饮食饲养中途，其中5只兔子死亡，剩下的8只兔分别在高脂喂养，分别于高脂饮食喂养2、3、4、5、6月后取病理。兔子麻醉固定后，切开腹部暴露主动脉血管观察：随着高脂饮食饲养时间延长，兔主动脉动脉管壁逐渐变厚，颜色由紫红色向黄色过渡；纵向剪开血管，高脂饮食喂养3月或更长时间的兔子主动脉可见多个黄色斑块附着于血管壁。取出大体标本后用甲醛溶液固定，采用冷冻切片常规HE染色方法，显微镜下观察主动脉血管。主动脉血管内膜明显增厚，增厚的内膜主要由平滑肌细胞组成，内可见多簇泡沫细胞积聚，血管内腔狭窄。

3 讨论

本实验成功利用高脂喂养建立兔动脉粥样硬化模型，利用PC-MRI技术得高脂喂养前兔的WSS为（17.03±1.14）×10-2Pa，高脂喂养后兔的WSS为（28.79±3.50）×10-2Pa，高脂喂养后的WSS大于高脂喂养的WSS，证明AS的形成与WSS具有一定相关性，WSS的增加是AS形成的重要因素之一。而有学者在研究人颈动脉粥样硬化斑块局部血流动力学改变时也提出斑块周围管壁切应力呈不均匀升高[16]。这与部分实验结果[17-18]相反，其原因可能是本实验探讨血管壁WSS与AS的关系，而文献[17-18]探讨整个动脉管腔内或一个区域内的WSS平均值与AS的关系。此外，本研究发现高脂喂养后，兔主动脉的平均流速出现显著增高，差异具有统计学意义，这可能与高脂喂养后兔的心脏负荷、主动脉的管腔改变、血液的粘稠度有关；高脂喂养后兔的血液呈高脂血症改变，其中增加的正常血胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等分子与血液粘稠度之间的关系，还需要后续实验进一步明确。

国内外多数有关WSS对血管内AS斑块形成机理以及内皮细胞功能和结构作用的研究多是“离体”研究，且通常假定不同部位的血管内WSS分布在动脉管壁内是恒定一致的，施加平均的切应力值对血管内皮细胞进行研究。而这个平均化的剪应力定律并不适用于“在体”的复杂环境，更是难以直接在“在体”状态下对AS斑块形成与发展规律的进行揭示[4]。本研究通过高饲喂养建立在体模型，模拟实际病理内环境下WSS在AS形成过程中的影响，以进一步验证WSS在动脉粥样硬化斑块形成过程中的重要作用。PC-MRI技术作为一种非侵入性技术，可以较好的对动物模型的斑块MRI特征、血流速度及壁切应力进行量化分析，从而提高对WSS对AS评估的准确性，而WSS被认为是斑块形成的重要因素。相关研究表明，WSS是血管内皮细胞功能与AS相关基因表达及血管结构的重要决定因素[4,19-20]，WSS通过诱导内皮细胞相关基因表达[21-22]，引起内皮细胞为适应力学环境变化发生形态和功能的调整，从而导致血管重塑[23-27]。目前对于动脉硬化的评估不再单纯依靠管腔的狭窄，而是更多地考虑是否有斑块形成、斑块的形态和组成成分，是否能够早期预测出现AS的可能性；PC-MRI可以早期通过WSS的改变间接发现斑块形成或提示AS形成，使得临床能够及时合理地予以治疗，减少患者出现更加严重的病情几率。

本研究发现利用PC-MRI的流速图后处理得到血管内三维血流流速分布图，可以更加直观得到高脂喂养前、后兔血流分布图，可以看到高脂喂养前兔的血流分布呈层流形式，最大流速位于管腔中央；而AS形成后，兔的最大血流流速均较正常时增加，流速中心发生偏移，病理切片时均可观察到相应动脉管壁下出现较大斑块的形成，病理分期均为纤维斑块期或粥样硬化期。这可能与兔主动脉AS斑块形成后，局部血管管腔较正常时有所缩小有关，导致血流速度有所增加。通过本实验可初步得出PC-MRI技术可以有效、早期检测靶血管的AS程度，而不依赖于管腔斑块的形成；PC-MRI作为较为新兴的MRI技术，是一种安全无创的检查手段，信息量大，又能为临床提供更为准确的信息，对患者出现较好预后疗效提供一个坚定的影像学基础。当然，PC-MRI也有不足之处，如扫描时间相对较长，表面线圈也有待改善，呼吸和心脏大血管运动也在一定程度上影响了图像质量。随着PC-MRI扫描技术及后处理软件不断开发、完善及改进，相信不久将来其可以在无创影像学检查方面有更广泛的应用。

本实验采用MRI技术无创、在体测定血流WSS的方法研究，开创性的建立一种适于临床适用的在体无创评估动脉AS的MRI方法。由于本次实验动物数量偏少，实验结论说服力稍欠强，需在后续实验继续增加样本量论证上述结论。