癫痫清颗粒对海人藻酸致癫痫大鼠行为学变化及NF-κB 信号通路的影响

齐 越， 贾 冬， 李纪彤， 姜 鸿， 秦文艳， 韦 丹， 张冰冰， 康 凯，陈 贺∗

（1. 辽宁中医药大学附属二院， 辽宁 沈阳 110034； 2. 辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室， 辽宁 沈阳 110847； 3. 辽宁中医药大学附属第三医院， 辽宁 沈阳 110032）

近年来临床研究及动物实验均证实， 癫痫与炎症的关系密不可分， 炎症反应可降低痫性发作阈值， 增加神经元兴奋性， 破坏血脑屏障， 介导神经元凋亡及突触重塑[1-2］。另外， 核因子-κB （NF-κB） 广泛分布于脑内多种细胞中，作为调节转录因子也与炎症反应密切相关。

癫痫清颗粒为辽宁省中医药研究院的院内制剂， 前期研究显示它可延长戊四唑及海人藻酸大鼠癫痫发作潜伏期，降低发作分级和持续时间， 增加脑组织白介素-4 （IL-4）水平， 抑制小胶质细胞及星形胶质细胞活化[3-8］。 本实验以海马内注射海人藻酸诱导癫痫大鼠模型， 考察癫痫清颗粒是否通过NF-κB 信号通路发挥抗炎作用， 进而对大鼠行为学产生影响， 从多方面多角度揭示该制剂抗癫痫作用机制，为临床用药提供必要的药理学基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性Wistar 大鼠60 只， 体质量（200±20） g， 由辽宁长生生物技术有限公司提供， 动物生产许可证号SCXK （辽） 2010-0001， 自由进食及饮水。

1.2 药物 癫痫清颗粒（辽宁中医药大学附属第二医院，批号20140110， 5.31 g 生药／kg）； 苯妥英钠片（天津力生制药股份有限公司， 批号1312027， 每片素片重0.1 g）。 海人藻酸（美国Sigma 公司， 批号MKBQ0 979 V， 含有量大于98%）； 水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司， 批号20100709）； NF-κB p65、 p-IκB、 IκB、 β-actin 试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 仪器 DW-5 脑立体定位仪（成都泰盟科技有限公司）； Stronger90 牙 科 钻 （韩 国 世 新 精 密 株 式 会 社）；Neofuge13R 高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）； Mini-PROTEAN©Tetra Cell 垂直电泳系统（美国伯乐有限公司）。

2 方法

2.1 分组与给药 60 只大鼠随机分为假手术组、 模型组、苯妥英钠组及癫痫清颗粒低、 中、 高剂量组， 每组10 只，分笼饲养， 自由摄食饮水。 根据前期实验结果并结合文献[10］， 设置癫痫清颗粒低、 中、 高剂量分别为4.74、9.47、 18.94 g／kg， 苯妥英钠剂量为0.03 g／kg， 各组大鼠给药量为20 mL／kg， 灌胃给药， 每天1 次， 连续7 d， 假手术组、 模型组大鼠给予等体积蒸馏水。

2.2 模型建立 采用前期课题组报道方法[6］。 第7 天给药结束后1 h， 350 mg／kg 水合氯醛麻醉大鼠， 将其固定于脑立体定位仪上， 头部备皮， 碘伏消毒2 次， 于颅顶正中线作一3～4 cm 切口， 钝性分离骨膜， 将囟门定位为零点，轻轻移动微量进样器， 中线旁开2.20 mm、 后3.00 mm，制作标记点， 垂直使用牙科钻， 轻钻至穿破骨膜， 垂直进针约3.70 mm， 3 min 内缓慢匀速注入1.0 μL 海人藻酸（1 μg／μL）， 留针5 min， 假手术组大鼠注射等体积生理盐水。 手术结束后， 缝合大鼠脑部肌肉及皮肤， 碘伏消毒2次， 整个手术过程注意保暖。

2.3 癫痫清颗粒对大鼠行为超兴奋性的影响[9］

2.3.1 接近反应实验 用笔垂直、 缓慢地从大鼠面前经过， 观察其表现， 然后进行评分， 评分标准： ①无反应；②大鼠嗅此笔； ③大鼠离开此笔； ④大鼠冻结； ⑤大鼠跳离此笔； ⑥大鼠跳向此笔或是袭击此笔。

2.3.2 响指反应实验 在离大鼠头部几厘米处发出响指声， 观察其反应， 然后进行评分， 评分标准： ①无反应；②大鼠轻轻跳跃或退缩或突然摇耳朵； ③大鼠大跳。

2.4 大鼠海马IκB／NF-κB 蛋白表达检测 采用Western blot 法。 末次给药1 h 后， 每组随机选取5 只大鼠， 迅速断头处死后冰盘上分离海马， 称定质量， 提取总蛋白， BSA法测定蛋白浓度， 10% 凝胶电泳， 转膜， 5% 脱脂牛奶封闭， 一抗孵育， 4 ℃下静置过夜， PBS 洗涤后加入二抗孵育， 再次洗涤后加入超敏ECL 化学发光试剂盒， 凝胶成像系统观察相关蛋白的表达， Quantity One 4.6.2 图像分析软件进行分析。

2.5 统计学分析 通过SPSS 13.0 软件进行处理， 数据用±s） 表示， 组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠死亡情况 海人藻酸注射后， 模型组、 苯妥英钠组及癫痫清颗粒低、 中、 高剂量组大鼠分别死亡3、 2、 3、2、 2 只。

3.2 癫痫清颗粒对大鼠行为学的影响 表1 显示， 与假手术组比较， 模型组大鼠接近反应、 响指反应评分显著增加（P＜0.01）； 与模型组比较， 癫痫清颗粒组两者显著降低（P＜0.01）。

表1 癫痫清颗粒对大鼠行为学的影响）

表1 癫痫清颗粒对大鼠行为学的影响）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01

组别 动物数／只剂量／（g·kg-1）接近反应评分响指反应评分假手术组 10 — 1.35±0.28 1.62±0.50模型组 7 — 2.16±0.41## 2.31±0.42##苯妥英钠组 8 0.03 1.52±0.32∗∗ 1.59±0.43癫痫清颗粒组 7 4.74 1.81±0.29∗∗ 1.39±0.29∗∗癫痫清颗粒组 8 9.47 1.54±0.31∗∗ 1.52±0.22∗∗癫痫清颗粒组 8 18.94 1.49±0.21∗∗ 1.68±0.11∗∗

3.3 癫痫清颗粒对大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表达的影响 图1、 表2 显示， 与假手术组比较， 模型组大鼠海马组织p-IκB、 NF-κB P65 表达显著增加（P＜0.01）， IκB 表达显著减少（P＜0.05）； 与模型组比较， 癫痫清颗粒中剂量组仅IκB 表达显著增加（P ＜0.01）， 而高剂量组p-IκB、NF-κB P65 表达显著减少（P＜0.05， P＜0.01）， IκB 表达显著增加（P＜0.01）。

4 讨论

图1 癫痫清颗粒对大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表达的影响

表2 癫痫清颗粒对大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表达的影响 ±s， n=5）

表2 癫痫清颗粒对大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表达的影响 ±s， n=5）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）p-IκB／β-actin IκB／β-actin NF-κB P65／β-actin假手术组 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 — 2.08±0.12∗∗0.52±0.12∗ 1.92±0.12∗苯妥英钠组 0.03 1.41±0.21# 1.12±0.22# 1.26±0.21#癫痫清颗粒组 4.74 1.97±0.31 0.76±0.21 1.83±0.19癫痫清颗粒组 9.47 1.83±0.11 1.22±0.17## 1.53±0.11癫痫清颗粒组 18.94 1.23±0.18## 1.38±0.20## 1.17±0.153#∗

大量研究表明， 癫痫是由于大脑神经元异常放电导致的脑电活动不平衡所致[10］， 而且常伴有一定程度的认知问题和适应障碍（如记忆困难、 注意力不集中、 睡眠不好、抑郁等）[11-12］。 2016 年一项研究表明， 高达50%的癫痫患者可能还具有异常行为， 如敌意、 冲动、 烦躁、 激动、 愤怒和攻击行为等[13］， 推测其可能与脑内兴奋和抑制的失衡有关。

目前， 在癫痫行为学研究的模型中药物主要有匹鲁卡品和海人藻酸， 动物大多为大、 小鼠， 可用评估实验包括高架十字迷宫实验、 明／暗实验、 旷场测试、 强迫游泳测试、 行为超兴奋性测试、 鼠尾悬停测试、 孔板测试、 MK-801 （地佐昔康） 诱导精神病样行为等， 其中行为超兴奋性测试中包括响指反应、 接近反应、 快速反应、 拾取反应。本实验在大鼠脑内CA1 区注射海人藻酸， 并考察癫痫清颗粒对大鼠行为超兴奋性的影响， 发现与假手术组比较， 模型组响指反应、 接近反应评分明显增加， 表明大鼠脑内CA1 区注射1.0 μg 海人藻酸可较好地模拟癫痫动物模型行为学变化； 与模型组比较， 癫痫清颗粒组可明显降低2 种评分， 表明它可较好地改善癫痫大鼠脑内兴奋性、 抑制性的失衡关系。

炎症与多种神经疾病密切相关， 如癫痫、 帕金森病、阿尔茨海默病、 中风等， 过去十年中炎症在癫痫病因中的重要作用引起了众多学者广泛关注， 支持炎性过程在癫痫中发挥潜在作用的关键证据来源于（1） 人类耐药性癫痫的治疗中， 抗炎药物可发挥一定抗癫痫作用； （2） 在手术切除难治性癫痫患者的脑组织中， 可见炎性几种介质；（3） 癫痫发作可促使脑内免疫细胞或小胶质细胞的激活，导致炎症细胞因子产生； （4） 自发性癫痫可导致永久性慢性炎症， 故抑制炎症因子表达可能对癫痫有治疗作用。

核因子-κB （NF-κB） 作为调节的转录因子， 主要在脑内的神经元、 星形胶质细胞及小胶质细胞中存在， 并参与炎症基因的表达、 细胞存活、 凋亡[14］， 当细胞处于静息状态时， 它与抑制性蛋白IκB 结合， 存在于细胞质内； 激活后， 其蛋白磷化后发生降解， 促使其进入细胞核内， 进一步激活靶基因， 调节炎症因子表达， 如iNOS、 COX-2、TNF-α、 IL-4 等[15-16］。 研究表明， 在慢性癫痫患者致痫灶的脑组织病理切片中可见胶质细胞活化、 增生、 NF-κB 过表达[17］； 癫痫动物模型中也可见小胶质细胞NF-κB 信号通路激活， 并伴随着炎症因子含量的增加， 可知NF-κB 参与了癫痫发病过程中的炎症信号通路的激活， 抑制其活化，可能成为干预癫痫发生发展的潜在治疗靶点。 前期课题组研究表明， 癫痫清颗粒可抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的活化[8］， 增加抗炎因子IL-4 表达[6］， 但具体作用机制尚不清楚； 本实验考察了癫痫清颗粒对NF-κB 信号通路的影响， 发现它可面向减少p-IκB、 NF-κB P65 表达， 抑制IκB降解， 可能通过抑制NF-κB 信号通路、 调控炎症因子表达来改善癫痫超兴奋行为， 从而发挥抗癫痫作用。